Orientador: Hiroshi Aoyama

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: No presente trabalho estudou-se a produção de extratos com atividade fenoloxidásica (FOx) pelo fungo termófilo lhermoasclls aurantiacus. Foram determinadas as melhores condições de cultivo para produção da atividade FOx em meio líquido. A adição de substratos polissacarídicos induziu altos...

Resumo: No presente trabalho estudou-se a produção de extratos com atividade fenoloxidásica (FOx) pelo fungo termófilo lhermoasclls aurantiacus. Foram determinadas as melhores condições de cultivo para produção da atividade FOx em meio líquido. A adição de substratos polissacarídicos induziu altos teores de atividade, quando comparado com cultura contendo somente glicose. Farelo de trigo foi o melhor substrato, e em concentração de 1,5% (m/v) induziu níveis entre 1 a 2 UI/mL de atividade. O tipo e tamanho do inóculo afetaram significativamente a produção de atividade, porém a agitação e a oxigenação das culturas não tiveram efeitos significativos. Um pH inicial do meio de cultura entre 6 e 8 favoreceu a produção de atividade FOx. Quando substratos polissacarídicos foram adicionados à cultura, diversas atividades enzimáticas relacionadas à degradação de lignina, em menor ou maior grau, foram detectadas: lacase, peroxidase, manganês-peroxidase, celobiose-quinona oxidoreductase e álcool veratrílico-oxidase. Nas mesmas condições não foi detectada atividade lignina-peroxidase. Após estabelecer as melhores condições para produção de atividade FOx pelo Taurantiacus, foram produzidos extratos com alta atividade para estudos de caracterização cinética. A atividade FOx presente no extrato bruto apresentou características semelhantes às fenoloxidases do tipo lacase. O extrato bruto oxidou uma variedade de substratos típicos de fenoloxidases, na ausência de H202. As maiores atividades foram alcançadas com ácido 2,2'azino-bis-(3 etil benzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), 2,6-dimetóxifenol (2,6-DMF) e odianisidina. Azida sódica e ácido tioglicólico foram os mais potentes inibidores da reação de oxidação catalizada pelo extrato bruto, ambos típicos inibidores de oxidases que contêm metal. O pH ótimo da reação de oxidação de o-dianisidina foi de 2,8, porém a estabilidade neste pH foi rapidamente perdida após 5 horas de incubação. A temperatura ótima de reação foi observada entre 70 e 80°C, e a estabilidade térmica do extrato bruto foi extremamente elevada, conservando mais de 50% da atividade após 5 horas de incubação à 100°C. Todas as características apresentadas pelo extrato bruto foram semelhantes às da maioria das fenoloxidases de tipo lacase, exceto a elevada temperatura ótima e termoestabilidade, nunca descritas para fenoloxidases de fungos mesófilos ou termófilos. Na intenção de desvendar a natureza responsável pela atividade FOx, procedeu-se à purificação de uma fração contendo tal atividade, a partir das culturas de Tauralltiacus. O trabalho teve que ser redirecionado devido ao inesperado resultado desta etapa, uma vez que a fração com atividade FOx atravessou uma membrana de ultrafiltração de 1,0 kDa e eluiu de uma coluna de Sephadex G-l0 em um volume correspondente a uma massa molecular £ 700 Da. Este resultado, junto com a elevada estabilidade térmica, descartou a possibilidade da existência de uma lacase ou alguma outra enzima, como responsável pela atividade FOx. A fração com alta atividade FOx (fração FOx), parcialmente purificada por Sephadex G10, foi caracterizada quanto às propriedades cinéticas e estruturais. As propriedades de pH e temperatura ótimos de atividade e estabilidade, foram semelhantes às do extrato bruto. A fração FOx oxidou os mesmos substratos que o extrato bruto, porém com maiores velocidades. Somente o efeito de inibidores foi diferente, observando-se uma diminuição do efeito inibitório em relação ao extrato bruto. A suspeita da presença de um sideróforo (complexante de Fe de baixa massa molecular), responsável pela atividade FOx, presente no extrato bruto e na fração, levou à procura destes compostos nas culturas de T.aurantiacus, utilizando o reagente universal Chromo azurol S (CAS). Através deste método foi possível confirmar a produção de sideróforos pelo fungo, em meio sólido e líquido, sendo que em meio líquido a máxima produção de atividade FOx coincidiu com uma mínima reação CASo Porém, apesar dos resultados positivos em meio de cultura, a fração FOx não reagiu com CASo. A caracterização estrutural da fração FOx revelou uma estrutura tipo hidroxamato com uma massa molecular aproximada de 530 Da, aparentemente sem aminoácidos, e com alguns metais (Ca, Mg, Fe) participando desta estrutura. Todos os resultados de caracterização estrutural sugeriram que o composto responsável pela atividade FOx, era um sideróforo pertencente à classe dos hidroxamatos. Estes resultados e outros preliminares, sugerem um mecanismo de ação para a fração FOx, onde o Fe presente na fração seria o responsável pelo potencial de oxidação de diversos substratos. Resultados preliminares indicam também que o F e participante na reação de oxidação de o-dianisidina é Fe (II). Assim, parece que a fração FOx complexa Fe (III) e, posteriormente, quando necessário esse Fe (III) seria reduzido para Fe (II) pela própria fração. Visando a aplicação biotecnológica dos extratos com alta atividade FOx de T. aurantiacus, estes foram utilizados no tratamento de uma polpa Kraft de Eucalipto e de um efluente, resultante do processo Kraft. Os extratos ativos mostraram-se eficientes no tratamento das polpas, obtendo-se 39% de deslignificação após 60 minutos à 500C e pH 3,0, porém nestas condições uma redução da viscosidade foi observada. A adição de ABTS, como um mediador redox, não aumentou a eficiência de deslignificação observada na sua ausência. Os efluentes, após 72 horas de tratamento com o extrato ativo de J:aurantiacus, à 250C e pH 4,0, apresentaram 60 a 70% de redução de fenóis, dependendo das condições de incubação. Sob condições estacionárias, obteve-se 67% de despolimerização e 5% de mineralização das cloroligninas de elevada massa molecular. Ao mesmo tempo, sob condições agitadas obteve-se 47% de mineralização. A redução da cor variou de 61 a 35%, sob condições agitadas ou estacionárias, respectivamente

Abstract: This work involves the phenoloxidase activity (POx) production by the thermophilic fungus Thermoascus auralltiacus. The best conditions for POx activity production in liquid culture were determined. The addition of lignocellulosic and polyssacharides substrates to culture induced high...

Abstract: This work involves the phenoloxidase activity (POx) production by the thermophilic fungus Thermoascus auralltiacus. The best conditions for POx activity production in liquid culture were determined. The addition of lignocellulosic and polyssacharides substrates to culture induced high leveI POx activity. The best substrate was the wheat bran which induced between 1-2 UI/mL, when utilized in concentration of 1.5% (w/v). The type and size of inoculum influenced the activity production, however the agitation and oxygenation of cultures did not affect it significantly. The initial pH between 6-8 supported the higher POx activity production. Different enzymatic activities related to lignin degradation such as laccase, peroxidase, Mn-peroxidase, cellobiose-quinone oxidoreductase and veratryl alcohol oxidase, but no ligninperoxidase, were detected in the cultures containing polyssacharides substrates. After the best conditions to POx activity production by Taurantiacus were established, crude extracts with high POx activity were utilized in the kinetic characterization. The POx activity showed similar characteristics to phenoloxidases laccase type. The crude extracts oxidized various typical substrates of phenoloxidases, in the absence of H202. The higher activities were produced with ABTS, 2,6-DMP and o-dianisidine. Typical inhibitors of oxidases containing metal, such as sodic azide and thioglycollic acid, were the most potent inhibitors of POx activity. The optimal pH for o-dianisidina oxidation was 2.8, but in this pH the stability was rapidly lost after 5 hours of incubation. The optimal temperature was found between 70 and 800C, and the crude extract showed an high thermostability, keeping more than 50% of activity after 5 hours of incubation at 100°C. All the characteristics of the crude extract were similar to phenoloxidases laccase type, except the high optimal temperature and thermostability, never report for phenoloxidases of mesophilic and thermophilic fungi. To elucidate the responsible nature for POx activity, the purification of an active fraction from Taurantiacus was conducted. The unexpected results of the purfication stage redirected this study. Because of that fraction with POx activity crossed over a 1 kDa ultrafiltration membrane, eluted from Sephadex G-10 column in a elution volume correponding with molecular mass of £ 700 Da, as well as presented high thermostability. The possibility of a laccase or some other enzyme to be responsible by POx activity was excluded. The kinetic and structural properties of the fraction partially purified by Sephadex G-10 with high POx activity, were studied. The properties of optimum pH and temperature for activity and stability were similar to those of the crude extract. The POx fraction oxidized the same substrates than the crude extract, but with higher rates. Unlike of the crude extract a decrease of inhibition was observed with POx fraction. The presence of a siderophore type compound (low-molecular mass Fe chelators) responsible by POx activity in the crude extracts as well in the partially purified fraction was then considered, and led to search for these compounds in the T.aurantiacus cultures, using the universal CAS reactive. Through this method the siderophore production by the fungus, in solid and liquid medium, was confirmed. The maximum production of POx activity in liquid medium coincided with a minimum CAS reaction. However, in spite of the positive results in culture medium, the POx fraction partially purified was not reactive with CAS. The structural characterization of partially purified POx fraction revealed a structure hydroxamate type with approximate molecular mass of 530 Da, apparently lacking aminoacids, and some metais (Ca, Mg, Fe) present in the structure. Thus, the existence of a siderophore hydroxamate type, responsible by POx activity, was suggested through of structural characterization. With these results an mechanism of substrate oxidation by POx fraction was proposed, in which Fe would be responsible by the oxidation of different substrates. Preliminary results showed that Fe is involved in the o-dianisidina oxidation as Fe(II). Apparently, the fraction possessed the ability to both chelate Fe(III) and reduce it to Fe(II), when necessary. The extracts with high POx activity fTom T.aurantiacus were used in biotechnological processes such as treatment of Eucalyptus Kraft pulps and effiuent result of Kraft processo The active extracts showed efficience on pulp biobleaching, with a 39% deslignification after 60 minutes at 500C and pH 3, however a viscosity reduction also was observed. The ABTS addition, as a redox mediator, it not increase the deslignification. After 72 hours of treatment with active extracts at 250C and pH 4, the effiuents showed between 60-70% phenol reduction, depending of incubation conditions. Under static conditions a 67% despolimerization and a 5% mineralization of chlorolignins high-molecular mass were observed. Under agitation conditions a 47% mineralization was observed. A colour reduction effiuent of61 or 35% was obtained under agitation or static conditions, respectively