Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Joyce Maria Annicchino Bizzacchi

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas

Resumo: A caracterização molecular na hemofilia A é dificultada pela grande extensão do gene do fator VIII (186Kb e 26 exons) e pela grande heterogeneidade das mutações nos pacientes de diferentes grupos étnicos estudados. Inicialmente a identificação da portadora do gene da hemofilia foi realizada...

Resumo: A caracterização molecular na hemofilia A é dificultada pela grande extensão do gene do fator VIII (186Kb e 26 exons) e pela grande heterogeneidade das mutações nos pacientes de diferentes grupos étnicos estudados. Inicialmente a identificação da portadora do gene da hemofilia foi realizada em 24 famílias de pacientes com hemofilia A utilizando-se os polimorfismos de restrição para as endonucleases BclI e HindIII. Foi possível identificar ou excluir portadoras do gene em 70% das famílias estudadas. Com o objetivo de definir as alterações genéticas de uma população distinta e realizar um aconselhamento genético preciso, foi levado a efeito um estudo das mutações no gene do fator VIII em 42 pacientes brasileiros portadores de hemofilia A. A análise por Southern hlot foi realizada nos pacientes com a forma grave da hemofilia para a detecção de inversão do gene do fator VIII com ruptura do gene do fator VIII e foi detectada em 13 de 21 do grupo com hemofilia grave. A metodologia incluiu a amplificação dos 26 exons do gene do fator VIII em quatro combinações diferentes de exons (Multiplex-PCR) e posterior análise do polimorfismo de conformÇlção em hélice simples do DNA (SSCP) não-radioativo no sistema PhastSystem@ Pharmacia com coloração pela prata. A confirmação do defeito molecular foi realizada pelo sequenciamento do exon com padrão eletroforético anormal no SSCP. O SSCP revelou um padrão anormal de migração em 85% dos casos de hemofilia moderada-leve e em 50% nos casos de hemofilia grave. Foram detectadas 16 mutações de ponto diferentes sendo que 11 não previamente descritas. Com essa combinação de metodologias foi possível identificar as alterações moleculares em 80% dos pacientes brasileiros com hemofilia A. O grande número de novas mutações está em acordo com a grande heterogeneidade das mutações descritas em outras populações

Abstract: The molecular characterization of the mutations in hemophilia A patients is hampered the large size of the factor VIII gene and the great heterogeneity of mutations. First of all we carried out a study of RLFPs for the enzymes BelI and HindIII in 24 families of hemophilia A patients and...

Abstract: The molecular characterization of the mutations in hemophilia A patients is hampered the large size of the factor VIII gene and the great heterogeneity of mutations. First of all we carried out a study of RLFPs for the enzymes BelI and HindIII in 24 families of hemophilia A patients and was possible to detect carriers in 70% of the families. Further in a attempt to elucidate the genetic basis of a distinct population and to perform a precise carrier detection we carried out a study of Brazilian patients with hemophilia A. In this study, we have carried out a protoeol involving multiplex PCR in which 19 exons were amplified in four different combinations followed by non-radioactive SSCP in order to screen for mutations. Southern blotting was used to detect inversion
of the factor VITI gene resulting from recombination between copies of the F8A gene located in intron 22 of the factor VITI gene and two copies close telomeric region of chromosome. Forty-two hemophilia A patients (21 with severe and 21 with mild-to-moderate disease) were studied. The inversion of factor VITI occurred in 13 out of 21 patients affected by severe hemophilia A. One patient showed a large extra band in addition to the three bands observed following Southern blotting with the F8A probe. An abnormal electrophoretic pattem of SSCP was detected in 85% and 50% of the patients affected by mild-to-moderate and severe disease, respectivelly. Sixteen different mutations were identified. Eleven mutations were novel and comprised nine point mutations and two small deletions. This study demonstrates that the methodology employed is safe and rapid and has a potential in detecting almost all the genetic defects of the studied hemophiliacs patients