Resumo: A cultura do citros tem sido afetada por diversos patógenos como Xylella fastidiosa (Xf), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Candidatus Liberibacter asiaticus (CaLas). Para o controle desses são necessárias grandes quantidades de defensivos agrícolas. Neste contexto, são importantes novas estratégias de manejo sustentável, como o uso de peptídeos antimicrobianos (PAM), que podem controlar o crescimento desses patógenos. Assim, foi realizada uma prospecção de sequências codificantes de peptídeos no banco de sequências expressas de citros (CitEST), e além disso, peptídeos descritos na literatura com atividade antimicrobiana foram utilizados. Para verificar a ação dos PAMs sobre os micro-organismos deste estudo, testes in vitro contendo os PAMs e patógenos foram realizados. Entre os PAMs avaliados in vitro CJ0714, EC0604, SC0902 e o PAM de citros PE1105 apresentaram atividade bactericida sobre Xcc e S. meliloti (bactéria utilizada por ser filogenéticamente próxima a CaLas) e bacterioestática para Rhizobium radiobacter. Todos os peptídeos avaliados in vitro para Xcc, tiveram suas atividades avaliadas em folha destacada, sob condições controladas, e em plantas acondicionadas em casa de vegetação. Os resultados em folha destacada corroboram com os dados obtidos in vitro. Em casa de vegetação os resultados com os PAMs CJ0714, AR0610 e PE1105 não foram semelhantes com os obtidos em testes in vitro e em folhas destacadas. Apesar disso, houve redução de sintomas em comparação com o controle positivo (somente a bactéria). Isso pode ter ocorrido devido a fatores e compostos presentes na planta e a instabilidade dos PAMs em condições mais próximas às naturais. Os PAMs que apresentaram resultados promissores in vitro e em folha destacada ou em trabalhos prévios foram clonados no vetor do CTV (Vírus da tristeza do citros) para avaliação da expressão transiente e sua ação sobre CaLas. Apesar dos resultados satisfatórios nos experimentos anteriores, não foram verificados efeitos destes PAMs sobre a população de CaLas quando expressos através do vetor viral do CTV. No entanto, pode-se observar redução da frequência de CaLas no inseto vetor Diaphorina citri alimentado em plantas com o PAM PE1106, já que o patógeno pode ser transmitido de modo transovariano de uma geração à outra do inseto. Nenhum peptídeo avaliado foi eficiente sobre o crescimento de Xf. Para avaliar o efeito dos PAMs sobre micro-organismos endofíticos foi utilizado Methylobacterium sp., sendo observado que os PAMs apresentaram atividade sobre esta bactéria. Testes para verificar a citotoxicidade dos PAMs para humanos foram realizados. O teste de hemólise permite verificar a atividade do peptídeo sobre eritrócito humano. Os PAMs que apresentaram as menores atividades hemolíticas foram SC0902, PE1105 e PE1106. Além disso, foi verificada a proliferação de linfócitos e desgranulação de mastócitos. Os PAMs CJ0714 e EC0604 apresentaram linfoproliferação e somente os PAMs PE1105 e PE1106, obtidos de citros, não induziram desgranulação de mastócitos. O PAM SC0902 apresentou bons resultados para a atividade antimicrobiana, mas induziu a desgranulação de mastócitos. Dessa forma, este trabalho apresenta o PAM, PE1105 como potencial para o controle desses patógenos bacterianos de citros, pois este apresentou atividade antimicrobiana e nenhum efeito citotóxico sobre células humanas Ver menos

Abstract: The citrus culture has been affected by various pathogens such as, Xylella fastidiosa (Xf), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and Candidatus Liberibacter asiaticus (CaLas).To control these pathogens, large quantities of pesticides are needed. In this context, are important new strategies for sustainable management, such as the use of antimicrobial peptides (PAM), which can control the growth of these pathogens. Here we have prospected at coding peptide sequences in the citrus database of expressed sequence (CitEST) and used other peptides previously tested. To verify the AMPs action on the microorganisms, in vitro tests were performed. Among the peptides evaluated in vitro, CJ0714, EC0604, SC0902 and PE1105 - citrus peptide showing bactericidal activity against Xcc and S. meliloti (phylogenetically close to CaLas) and bacteriostatic effect on Rhizobium radiobacter. All peptides evaluated in vitro for Xcc, had their activities evaluated in a detached leafs, under controlled conditions, and plants placed in the greenhouse. The results in detached leaf results corroborated with the in vitro data. In the greenhouse, results for CJ0714, AR0610 and PE1105 peptides were not similar with those obtained in vitro and in detached leaf. Nevertheless, the presence of symptoms was reduced as compared with the positive control (bacteria only). This may be due to factors and compounds present in the plant and to the instability of the peptide at conditions close to the natural ones. Peptides that showed promising results in vitro and in detached leaf or in previous works were cloned into the CTV (Citrus Tristeza Virus) vector to evaluate the transient expression and its action on CaLas. Despite the satisfactory results in previous experiments, it was not possible to observe the PAM effect on CaLas population when expressed through CTV vector. Nevertheless, reduction of the frequency of the bacteria in the insect vector was observed when Diaphorina citri fed on plants with AMP PE1106, since the pathogen can be transmitted from one generation to another by transovarial mode. None peptides evaluated was efficiently on the growth of Xf. To evaluate the effects of the AMPs on endophytic microorganisms, Methylobacterium sp. was used and it was observed that peptides exhibit activity against this bacterium. Tests to check the cytotoxicity of these AMPs for humans were performed. The hemolysis test allows checking the activity of the peptide on human erythrocyte. The AMPs that showed the lowest hemolytic activities were SC0902, PE1105 and PE1106. Furthermore, we noticed the proliferation of lymphocytes and mast cell desgranulation. Thus, this work presents PAM, PE1105 as potential for the control of these bacterial pathogens of citrus because it showed antimicrobial activity and no cytotoxic effect on human cells Ver menos