Resumo: Recentes análises filogenéticas e citogenéticas têm revelado grande diversidade dentre leiuperídeos do grupo Physalaemus cuvieri. O parafiletismo de P. cuvieri em relação a Physalaemus ephippifer foi inferido com base na análise de sequências de DNA, e linhagens reconhecidas dentre indivíduos de P. cuvieri parecem representar espécies ainda não descritas. A espécie Physalaemus ephippifer ocorre na foz do Rio Amazonas no Brasil e possivelmente na Guiana, mas sua correta distribuição geográfica permanece desconhecida. Análises citogenéticas de indivíduos de P. ephippifer da localidade-tipo (Belém-PA) revelaram um interessante heteromorfismo entre os homólogos do par cromossômico 8 de fêmeas, caracterizando a presença de um sistema de determinação sexual cromossômico ZZ/ZW. Os cromossomos Z e W apresentam uma NOR distal no braço longo, adjacente a uma banda heterocromática terminal, e o cromossomo W difere do Z por apresentar um segmento terminal no braço curto que inclui uma NOR e uma banda heterocromática. As NORs de P. ephippifer se mostraram co-localizadas, em experimentos de hibridação in situ, com as sequências de DNA repetitivo Pep194. Com o objetivo de contribuir para a investigação da diversidade genética e citogenética de populações amazônicas de Physalaemus do grupo P. cuvieri, analisamos as relações filogenéticas e os cariótipos de indivíduos de P. ephippifer de Santa Isabel-PA e exemplares coletados em localidades do Pará (Monte Alegre, Óbidos, Alenquer, Curuá, Parauapebas e Prainha) e de Roraima (Viruá), cuja identificação taxonômica é incerta. Para tanto, as preparações cromossômicas obtidas de machos a partir de suspensões de células do intestino e testículo foram submetidas à coloração convencional por Giemsa, bandamento C, coloração com DAPI, impregnação por prata e experimentos de hibridação in situ com sondas de DNA repetitivo Pep194 e DNA ribossomal 28S. Além disso, utilizamos uma sonda, chamada de Zqter, produzida a partir de um segmento microdissecado da região terminal do braço longo do cromossomo Z de P. ephippifer. As relações filogenéticas foram inferidas com base em sequências de DNA mitocondrial dos genes 12S, RNAt-val e 16S, utilizando o critério de máxima parcimônia. Os cariótipos dos indivíduos de Physalaemus sp. em análise foram semelhantes entre si, porém três citótipos foram reconhecidos devido ao padrão diferencial na distribuição das NORs no par 8. Os cariótipos dos espécimes de Monte Alegre, Óbidos, Alenquer, Prainha e Curuá (Citótipo I) e Parque Nacional do Viruá (Citótipo II) mostraram uma NOR pericentromérica no braço curto do par 8, porém apenas o Citótipo I foi portador de uma NOR terminal no braço longo desse mesmo par. O exemplar de Parauapebas (Citótipo III) mostrou duas NORs no braço longo dos cromossomos do par 8. Nas inferências filogenéticas, os exemplares de Physalaemus sp. portadores dos Citótipos I e II foram recuperados no mesmo clado (Clado A). Neste clado, foi possível observar uma subestruturação que acompanha a variação cariotípica detectada, no entanto a distância genética entre os dois grupos em questão, inferida com base em sequências parciais do gene 16S, foi baixa (0,1%). É provável, portanto, que os dois citótipos representem uma variação intraespecífica. O exemplar de Parauapebas incluído nas análises filogenéticas (Clado B) apresentou-se como grupo-irmão de um clado que incluiu P. ephippifer (Clado C) e o clado correspondente a uma das linhagens de P. cuvieri (Clado D, equivalente à Linhagem 1 de P. cuvieri, que agrupa indivíduos do norte e do nordeste do Brasil). A alta distância genética do Clado A em relação aos Clados B-D, inferida com base em segmento do gene 16S, sugere que o Clado A possa representar uma espécie ainda não descrita. Nas metáfases de indivíduos de Viruá, Alenquer e Curuá a sonda Zqter foi detectada na região pericentromérica do braço curto do par 8, adjacente às NORs detectadas pela sonda Pep194, sugerindo que esta região é homeóloga a região terminal ao braço longo do Z de P. ephippifer. As homelogias encontradas sugerem um possível evento de inversão cromossômica durante diferenciação desses cariótipos. A sonda Pep194 detectou, além das NORs dos cromossomos Z e W de P. ephippifer e da NOR pericentromérica de Physalaemus sp., as NORs dos cromossomos 8 e 9 de indivíduos de P. cuvieri de Urbano Santos-MA e os cromossomos 8 e 11 de indivíduos de P. cuvieri de Palestina-SP. Em contraste, essa sonda não detectou a NOR pericentromérica do cromossomo 9 de P. centralis, uma espécie mais distantemente relacionada filogeneticamente a P. cuvieri e P. ephippifer Ver menos

Abstract: Recent phylogenetic and cytogenetic analyses have revealed high diversity among leiuperids of the Physalaemus cuvieri group. The paraphyly of P. cuvieri with respect to Physalaemus ephippifer was inferred based on the analysis of DNA sequences, and genetic lineages that included individuals at first identified as P. cuvieri may represent undescribed species. P. ephippifer occurs at the mouth of the Amazon River in Brazil and possibly in Guyana, but its geographical distribution is unclear. Cytogenetic analyses of individuals of P. ephippifer from the type locality (Belém-PA) revealed an interesting heteromorphism between the homologous chromosomes of pair 8 in females, which characterized the presence of a chromosomal sex determination system ZZ/ZW. The Z and W chromosomes have a distal NOR in the long arm, adjacent to a terminal heterochromatic band, and the W chromosome differs from Z chromosome by a terminal segment in the short arm that comprises a NOR and a heterochromatic band. The NORs of P. ephippifer are shown co-located with DNA repetitive Pep194 in in situ hybridization experiments. Aiming to contribute to the investigation of the genetic and cytogenetic diversity of Amazonian populations belonging to P. cuvieri group, we analyzed the phylogenetic relationships and the karyotypes of individuals of P. ephippifer from Santa Isabel-PA and specimens collected from seven localities in the states of Pará (Monte Alegre, Óbidos, Alenquer, Curuá, Parauapebas and Prainha) and Roraima (Viruá), for which the taxonomic identification is uncertain. Chromosome preparations obtained from male individuals were subjected to conventional staining with Giemsa, C-banding, DAPI staining, silver impregnation and in situ hybridization with probes for the repetitive DNA Pep194 and ribosomal DNA 28S. In addition, we used a probe, named Zqter probe, produced from a segment microdissected from the terminal region of the long arm of the Z chromosome of P. ephippifer. Phylogenetic relationships were inferred based on mitochondrial DNA sequences of 12S, tRNA-val and 16S genes, using the criterion of maximum parsimony. The karyotypes of the individuals of Physalaemus sp. analyzed were similar, but three cytotypes were recognized with differential distribution of NORs in pair 8. Individuals from Monte Alegre, Óbidos, Alenquer, Prainha and Curuá (Cytotype I) showed a pericentromeric NOR in the short arm of pair 8 and a terminal NORin the long arm. In the male karyotypes of Viruá (Cytotype II), the NOR was located in the pericentromeric region of the short arm of pair 8. The individuals from Parauapebas (Cytotype III) showed two NORs in the long arm of chromosome pair 8. In the phylogenetic inferences, the specimens of Physalaemus sp. with Cytotypes I and II were nested in the same clade (Clade A). This clade showed a substructure that reflected the two karyotypic groups detected. The genetic distance between these two groups, however, inferred from partial sequences of the 16S gene, was low 0,1 %. It is likely, therefore, that the two cytotypes represent an intraspecific variation. The exemplar of Parauapebas included in the phylogenetic analysis (Clade B) was the sister group of a clade that included P. ephippifer (Clade C) and the clade corresponding to one of the lineages of P. cuvieri (Clade D, equivalent to Lineage 1 of P. cuvieri, which groups individuals of northern and northeastern Brazil). The high genetic distance between Clade A and clades B-D, inferred from 16S gene segment, suggests that Clade A may represent an undescribed species. In metaphases of individuals from Viruá, Alenquer and Curuá, the Zqter probe was detected in the pericentromeric region of the short arm of pair 8, adjacent to the NOR detected by the probe Pep194, suggesting that this region is homeologous with the terminal region of the long arm of the Z chromosome of P. ephippifer. The inferred homeologies suggest a possible event of chromosomal inversion along the differentiation of these karyotypes. The Pep194 probe detected, beyond the NORs of the Z and W chromosomes of P. ephippifer and the pericentromeric NOR of chromosomes 8 of the cytotypes of Physalaemus sp., the NORs of chromosomes 8 and 9 of individuals of P. cuvieri from Urbano Santos-MA and chromosomes 8 and 11 of individuals P. cuvieri from Palestina-SP. In contrast, this probe did not detect the pericentromeric NOR of chromosome 9 of P. centralis, which is distantly related phylogenetically to P. cuvieri and P. ephippifer Ver menos