Orientador: Heloisa Helena de Araújo Ferreira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Estudos mostram que o sulfeto de hidrogênio (H2S) possui um papel relevante na fisiopatologia de doenças pulmonares. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos pelos quais o H2S influência a apoptose, o infiltrado de células inflamatórias, e o remodelamento das vias respiratórias...

Resumo: Estudos mostram que o sulfeto de hidrogênio (H2S) possui um papel relevante na fisiopatologia de doenças pulmonares. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos pelos quais o H2S influência a apoptose, o infiltrado de células inflamatórias, e o remodelamento das vias respiratórias na inflamação alérgica pulmonar. Para isso, camundongos BALB-C foram sensibilizados e desafiados com ovalbunina (OVA). Os camundongos tratados receberam o hidrosulfeto de sódio (NaHS) 30 minutos antes do desafio com OVA (OVA/NaHS). Alguns camundongos sensibilizados receberam salina estéril sem a OVA na ocasião do desafio (grupo salina). A eutanásia dos animais foi realizada 48 horas após o desafio, quando foi coletado o lavado broncoalveolar, para separação imunomagnética de eosinófilos para verificação da apoptose desta célula, e retirados os pulmões. O lobo direito dos pulmões foram homogeneizados para verificação da expressão das proteínas Caspase 3, Caspase 9, Bax, Fas-L e TGF-?1 e para dosagem dos níveis de citocinas. O lobo esquerdo foi fixado no formol para alguns procedimentos de análise histológica. Verificamos o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar pela coloração HE (hematoxilina/eosina) e o colágeno no pulmão utilizando a coloração TM (tricômico de masson). Observamos, também, a apoptose in situ em células epiteliais do pulmão através do ensaio TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Por fim, realizamos a imunohistoquímica no pulmão para verificação da expressão das enzimas cistationia-?-liase (CSE) e cistationina-?-sintetase (CBS). Os resultados dos camundongos alérgicos não tratados (OVA) mostraram um aumento do infiltrado inflamatório ao redor dos brônquios e bronquíolos, com prevalência de eosinófilos. O tratamento com NaHS foi efetivo em reduzir este infiltrado inflamatório. No grupo salina não se verificou infiltrado inflamatório. Ao estudarmos a expressão das proteínas Caspase 3, Caspase 9, Fas-L e Bax, observamos que nos animais sensibilizados e desafiados (OVA) a expressão da Caspase 3, Caspase 9 e Bax não sofrem qualquer alteração. No entanto, o tratamento dos animais com NaHS diminui a expressão da Caspase 3, mas não da Caspase 9 e Bax. A expressão do Fas-L é aumentada nos animais sensibilizados e desafiados (OVA) quando comparado ao grupo salina e o tratamento com NaHS diminui essa expressão á níveis semelhantes ao grupo salina. Não foram observadas modificações na apoptose dos eosinófilos isolados dos camundongos alérgicos ou dos tratados com NaHS. Os animais sensibilizados e desafiados apresentaram um aumento da apoptose de células do epitélio brônquico quando comparado ao grupo salina. O tratamento com NaHS foi capaz de reduzir esta apoptose a níveis semelhantes ao grupo salina. Verificamos um aumento dos níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-25 nos pulmões dos camundongos sensibilizados e desafiados, e este aumento foi evitado pelo o tratamento dos animais com NaHS, com exceção da IL-13. A concentração da eotaxina, fator quimiotático de eosinófilos, não sofreu qualquer influência do tratamento com NaHS nos pulmões dos camundongos sensibilizados em resposta ao desafio com OVA. O desafio com OVA aumentou os níveis do IFN-? no homogenato pulmonar, e este aumento foi revertido pelo tratamento dos animais com NaHS a níveis semelhantes aos observados no grupo salina. Os níveis de TNF-? não sofreram alteração do desafio com OVA e nem do tratamento com NaHS. Relacionado ao remodelamento das vias aéreas, não houve formação de colágeno peribronquiolar nos camundongos sensibilizados e desafiados com OVA e nem naqueles tratados com NaHS. O mesmo foi observado na expressão do TGF-?1 que não sofreu influência nem da indução da alergia pulmonar pela OVA nem do tratamento com NaHS. A expressão da enzima CSE tanto no epitélio brônquico como no endotélio vascular estava aumentada nos pulmões dos camundongos alérgicos, e este aumento foi amplificado pelo tratamento com NaHS. Diferentemente da expressão desta enzima, o tratamento com NaHS não modificou a expressão da enzima CBS em nenhuma das estruturas pulmonares estudadas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que o H2S tem um efeito protetor no pulmão contra os danos provocados pela alergia. A redução do infiltrado de eosinófilos peribronquiolar pode ser explicada pela diminuição nos níveis pulmonares da IL-4, IL-5 e IL-25, devido à ação do H2S. O H2S também evitou a apoptose e, consequentemente, a destruição do epitélio brônquico, o que contribui para a diminuição da inflamação no processo alérgico pulmonar. A enzima CSE pode estar envolvida neste processo. O H2S possui um importante potencial terapêutico para as doenças alérgicas pulmonares como a asma

Abstract: Many studies show that hydrogen sulfide (H2S) has a relevant role in the pathophysiology of lung diseases. The objective of this study was to investigate the mechanisms by which H2S influence apoptosis, the inflammatory cell infiltrate, and airway remodeling in allergic lung inflammation....

Abstract: Many studies show that hydrogen sulfide (H2S) has a relevant role in the pathophysiology of lung diseases. The objective of this study was to investigate the mechanisms by which H2S influence apoptosis, the inflammatory cell infiltrate, and airway remodeling in allergic lung inflammation. To this end, BALB-C mice were sensitized and challenged with ovalbunina (OVA). The treated mice received the sodium hydrosulfide (NaHS) 30 minutes before challenge with OVA (OVA / NaHS). Some sensitized mice received sterile saline without OVA at the time of challenge (saline group). The euthanasia was performed 48 hours after challenge, when it was collected bronchoalveolar lavage for immunomagnetic separation of eosinophils to check this cell apoptosis, and the lungs were removed. The right lobe of the lungs was homogenized for checking the expression of caspase 3, caspase 9, Bax, Fas-L and TGF-?1 protein and for determination of cytokine levels. The left lobe was fixed in formalin for histological analysis. We checked the inflammatory infiltrate in the lung parenchyma by HE staining (hematoxylin/eosin) and collagen in the lung using the TM (Masson trichrome) staining. We also observe in situ apoptosis in lung epithelial cells by TUNEL assay (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Finally, we performed immunohistochemistry in the lung to check the expression of cistationia ?-lyase enzymes (CSE) and cystathionine ?-synthase (CBS). The results of allergy untreated mice (OVA) showed an increase in inflammatory infiltrates around the bronchi and bronchioles, with a prevalence of eosinophils. Treatment with NaHS has been effective in reducing this inflammatory infiltrate. In saline there was no inflammatory infiltrate. By studying the expression of Caspase 3, Caspase 9, Fas-L and Bax proteins, we observed that in animals sensitized and challenged (OVA) the expression of Caspase 3, Caspase 9 and Bax remain unchanged. However, treatment of the animals with NaHS decreases the expression of Caspase 3 but not caspase 9 and Bax. The Fas-L expression is increased in sensitized and challenged (OVA) animals when compared to saline treatment group and NaHS will decrease the expression levels similar to saline group. No changes in apoptosis of eosinophils isolated from allergic mice or those treated with NaHS were observed. The sensitized and challenged animals showed an increase in apoptosis in bronchial epithelial cells as compared to saline group. Treatment with NaHS was able to reduce this apoptosis to similar levels to the saline group. Verified increased levels of IL-4, IL-5, IL-13 and IL-25 in the lungs of sensitized and challenged mice, and this increase was prevented by treating the animals with NaHS, with the exception of IL-13. The concentration of eotaxin, eosinophil chemotactic factor, suffered no influence of treatment with NaHS in the lungs of sensitized in response to challenge with OVA mice. The OVA challenge increased the levels of IFN-? in lung homogenates, and this increase was reversed by treating animals with NaHS levels similar to those observed in the saline group. The levels of TNF-? did not change the OVA challenge nor treatment with NaHS. Related to airway remodeling, there was no formation of peribronchial collagen in mice sensitized and challenged with OVA and not in those treated with NaHS. The same was observed in the expression of TGF-?1 not affected either by the induction of OVA lung allergy or treatment with NaHS. The expression of both enzyme CSE in the bronchial epithelium and the vascular endothelium was increased in the lungs of allergic mice, and this increase was amplified by treatment with NaHS. Unlike the expression of this enzyme, treatment with NaHS did not alter the expression of the enzyme CBS in any of the studied pulmonary structures. In conclusion, our results suggest that H2S has a protective effect against lung damage caused by allergy. The reduced peribronchiolar infiltrate of eosinophils can be explained by the reduction in lung levels of IL-4, IL-5 and IL-25 due to the action of H2S. H2S also avoided apoptosis, and consequently, the destruction of the bronchial epithelium, which contributes to the reduction of pulmonary inflammation in allergic process. The CSE enzyme may be involved in this process. H2S has an important therapeutic potential for allergic pulmonary disorders such as asthma.?