Orientador: Sergio Marangoni

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: As neurotoxinas escorpiônicas têm sido classificadas em duas grandes categorias: as a -toxinas (encontradas em espécies do Velho Mundo) que retardam a inativação dos canais de sódio e as ß-toxinas (provenientes de espécies do Novo Mundo), que induzem um estado persistente de despolarização...

Resumo: As neurotoxinas escorpiônicas têm sido classificadas em duas grandes categorias: as a -toxinas (encontradas em espécies do Velho Mundo) que retardam a inativação dos canais de sódio e as ß-toxinas (provenientes de espécies do Novo Mundo), que induzem um estado persistente de despolarização das membranas de células excitáveis (neurônios). A TsTX-V foi obtida por cromatografia de troca iônica em CM-Cellulose 52 e teve seu grau de pureza confirmado por cromatografia de fase reversa em HPLC e por eletroforese em PAGE-SDS Tricina. A estrutura primária da TsTX-V foi determinada por degradação automática de Edman, a partir da proteína pura carboximetilada e reduzida e de seus digestos peptídicos obtidos por Tripsina e Protease V8. Sua seqüência, 64 resíduos de aminoácidos e uma massa molecular, calculada através da somatória dos resíduos, de 7,2 kDa, contendo oito resíduos de cisteina. Testes eletrofisiológicos realizados em nervo vago de coelho mostraram que a toxina TsTX-V (0,03µg/mL) induz um prolongamento do potencial de ação das fibras B do nervo vago devido ao retardo na inativação do canal de Na+. A 0,3µg/mL ela induz também uma despolarização do nervo. Esses efeitos são irreversíveis e podem ser abolido por tetrodoxina (200 - 500 mM), mas não por um aumento da concentração de potássio no meio externo. Estes resultados demosntraram que TsTX-V é uma a-toxina (Arantes et aI., 1994). Em ilhotas de Langerhans, isoladas de ratos, a TsTX-V (a-toxina) potencializou a secreção de insulina, na ausência ou na presença de 8,3 mM de glicose. A Ts-g potencializou a secreção de insulina por 8,3 mM de glicose. A toxina TsTX-V (5,6 mg/ ml) induziu um aumento do efluxo de 86Rb+ cerca de 2,0 a 2,4 vezes em relação ao induzido por 8,3 mM de glicose em ilhotas de Langerhans. Este efeito foi persistente e lentamente reversível. Efeito similar foi observado em presença de (110 mM) de veratridina, substância que retarda a inativação de canais de sódio sensíveis a voltagem. Estes dados sugerem que a toxina TsTX-V prolonga o período de despolarização das células B, ativando indiretamente os canais de K+ dependente de voltagem, mantendo, desta forma, a permeabilidade da membrana ao K+, medida indiretamente pelo efluxo de 86Rb+, mateve-se elevada.. A estrutura tridimensional da toxina TsTX-V foi determinada através de modelagem molecular, utilizando-se para isso os dados cristalográficos da toxina CsE-V3, cujas coordenadas estão depositadas em banco de dados, e da toxina AaH II. De um modo geral, ela tem as feições típicas das neurotoxinas de escorpiões, como a formação em a.-hélice e as três folhas b antiparalelas, mas diferindo quanto à disposição das alças J e B, e da região N-terminal e Carboxi terminal, quando comparados com a toxina do Androctonus autralis Hector (AaH II). O dendograma obtido através das similaridades e coincidências de resíduos e do alinhamento das estruturas secundárias mostra que as toxinas do Novo Mundo podem ser subdivididas em três subgrupos: duas (beta) b e uma (alfa) a

Abstract: Antimamals scorpion neurotoxins are classified in two groups: a-toxins (from the Old World species) that induce a slowing down of the inactivation of the sodium channel, and b-toxins (from the New World species), that induce a persistant depolarization of excitable cell membranes. TsTX-V...

Abstract: Antimamals scorpion neurotoxins are classified in two groups: a-toxins (from the Old World species) that induce a slowing down of the inactivation of the sodium channel, and b-toxins (from the New World species), that induce a persistant depolarization of excitable cell membranes. TsTX-V was obtained by ion-exchange chromatography on CM-Cellulose 52 and its of purity was confirmed by reverse phase chromatography and Tricine SDS-PAGE. Primary structure of TsTX-V has been determined by automatic Edman degradation from the reduced and carboxymethyled protein and digestic peptide obtained by Protease V8 and Tripsin. Its sequence shows, a total of 64 aminoacid residues, a calculated molecular weight of 7200.and eight cysteine residues. Electrophysiological assay performed on the vagus nerve of rabit, showed that TsTX-V (0,03 ).mg/mL) induce a persistent depolarized state during long time on B fibers, this effect was abolished by addition of tetrodoxin (200 - 500 mM) but not abolished by high externaI potassium depolarization. Those effects characterized TsTX-V as a-toxins.(Arantes et al, 1994) On isolated rat islets of Langerhans TsTX-V induced insulin secretion in both absecence or presence os glucose (8,3 mM)presence of glucose 8,3 mM, but in absence any effect was observed. However, Tsg (b toxin) potentiated insulin secretion in the presence of glucose 8,3 mM. TsTX-V (5,6 mg/mL) induced a 86Rb+ outflow increase, 2,0~2,4 fold the rate of the marker outflow in the presence of 8,3 mM glucose. This effect was persistent and slowly reversible, showing similarity to that induced by 100 mM veratridine, an agent that prolong the open period of Na+ channel, delaying their inactivation. This suggested that, by extending the depolarized period, TsTX-V indirectly affect b cells voltage dependent K+ channels, thus increasing K+ permeability. Homology studies performed with TsTX-V and other scorpion neurotoxins revealed common folding among them, for example the presence of highly conserved regions and residues and the presence of eight cystein residues at same locations. The three-dimensional structure of TsTX-V was determined by modeling from crystalographic determined structure of CsE-V3 and AaH II. TsTX-V has conserved a and b structure present in other scorpion neurotoxins. Basically its three-dimensional structure is similar to CsE-V3 and AaH lI, but differs in the folding patterns in the J and B loops. Computer simulation performed on the three-dimensional structure obtained by molecular modeling, shows that the C-terminal and N-terminal loops have a great degree of freedom. On the other hand J and B loops did not show great diferences in its leght spatial disposition whem compared with atoxic fraction TsTX-VI or Ts-g (b toxins)