Orientador: Anete Pereira de Souza.

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A seringueira (Hevea brasiliensis), espécie nativa da Amazônia, é a maior fonte de borracha natural do mundo. Programas de melhoramento genético da seringueira têm sido cruciais para a obtenção de caracteres desejáveis. Entretanto, o ciclo de melhoramento da seringueira é muito longo (cerca...

Resumo: A seringueira (Hevea brasiliensis), espécie nativa da Amazônia, é a maior fonte de borracha natural do mundo. Programas de melhoramento genético da seringueira têm sido cruciais para a obtenção de caracteres desejáveis. Entretanto, o ciclo de melhoramento da seringueira é muito longo (cerca de 30 anos), tornando-se essencial o desenvolvimento de novas técnicas de avaliação precoce. As bibliotecas de cDNA e Expressed Sequence Tags (ESTs) são ferramentas muito importantes em biologia molecular: possibilitam identificar genes preferencialmente expressos em tecidos ou tipos celulares e também são valiosas fontes de marcadores polimórficos, instrumentos poderosos para genotipagem e mapeamento molecular. O uso de marcadores derivados de ESTs permite construir mapas funcionais, nos quais são posicionados genes transcritos ou regiões próximas aos genes. Este tipo de mapeamento é importante para estudos de associação gene-característica, e identificação de genes candidatos. Este trabalho objetivou a construção de bibliotecas de cDNA de diferentes tecidos (painel, látex e folha) e tratamentos (exposição ao frio e infecção controlada por Microcyclus ulei) de seringueira para desenvolver sequências EST e marcadores moleculares gene-direcionados a partir destas sequências, para aumentar a saturação de um mapa integrado baseado em microssatélites, no qual identificaram 18 quantitative trait loci (QTLs) para características de crescimento, construído previamente em nosso laboratório. Foram sequenciados 10.464 clones, gerando 8.551 ESTs de alta qualidade que agrupadas formaram 5.211 unigenes. Destes, 3.582 (68,7%) apresentam similaridade com uma proteína hipotética ou expressa. Foram desenvolvidos 173 marcadores EST-SSR e 43 marcadores SNP para H. brasiliensis. 150 EST-SSRs (87%) podem estar associados a genes funcionais, e 98,8% foram transferidos para outras espécies de Hevea, sugerindo que o gênero seja um complexo formado pelas diferentes espécies. Os SNPs foram identificados em 13 ESTs similares a proteínas de resposta a estresse, desenvolvimento e síntese de látex. Seis sequências foram abundantes nas bibliotecas de exposição ao frio e análises de expressão demonstraram que a expressão de cinco sequências aumentou durante o experimento, principalmente a expressão de duas sequências que foi aumentada mais de 70 vezes. Dos EST-SSRs desenvolvidos, 46 foram genotipados na população segregante F1 com 270 indivíduos, e estes marcadores foram adicionados ao mapa genético de seringueira, totalizando 330 marcadores. O programa OneMap foi usado para a construção do mapa que possui 3.068,9 cM de extensão e 22 grupos de ligação (LGs). Cinco locos foram mapeados em regiões QTL, e os transcritos de três são similares a proteínas de resposta a estresse e desenvolvimento. Estes locos podem ser genes candidatos para estudos relacionados a características de crescimento em seringueira. Até o momento, este é o primeiro trabalho em seringueira que combina análises de ESTs de diferentes tecidos e tratamentos, e análises sobre a exposição a baixas temperaturas, em vários genótipos de seringueira. Os novos marcadores adicionados ao mapa poderão auxiliar na identificação de genes de interesse e de QTLs para outras características de importância agronômica. Os vários marcadores gene-direcionados desenvolvidos serão utilizados para mapeamento e posicionamento de possíveis genes em outras populações de mapeamento que estão sendo avaliadas no Laboratório de Análise Genética e Molecular

Abstract: Rubber tree (Hevea brasiliensis), native species of the Amazon, is world¿s major source of natural rubber. Rubber tree breeding programs have been fundamental for the selection of desirable traits. However, the breeding cycle is time consuming (around 30 years), which makes the development...

Abstract: Rubber tree (Hevea brasiliensis), native species of the Amazon, is world¿s major source of natural rubber. Rubber tree breeding programs have been fundamental for the selection of desirable traits. However, the breeding cycle is time consuming (around 30 years), which makes the development of new techniques for early evaluation a necessity. cDNA libraries and Expressed Sequence Tags (ESTs) are very important tools in molecular biology: they enable the identification of genes preferentially expressed in tissues or cellular types and are also a valuable resource of polymorphic markers, powerful instruments for genotyping and molecular mapping. The use of EST-derived markers allows the construction of functional maps, wherein expressed genes or regions near genes are positioned. This type of mapping is important for gene-trait association studies and candidate genes identification. The present study aimed at the construction of cDNA libraries from different tissues (panel, latex and leave) and treatments (cold exposure and Microcyclus ulei controlled infection) of rubber tree for the development of EST sequences and gene-targeted molecular markers, to raise the saturation of a microsatellite-based integrated genetic map previously constructed in our laboratory, in which 18 quantitative trait loci (QTLs) related to growth traits were identified. Sequencing of 10.464 clones generated 8,551 high quality ESTs that were clustered into 5,211 unigenes. Among these, 3,582 (68.7%) showed similarity to a hypothetical or expressed protein. A total of 173 EST-SSR and 43 SNP markers were developed for H. brasiliensis. 150 SSRs (87%) could be associated with functional genes, and 98.8% were transferred to other Hevea species, suggesting that the genus is a complex formed by different species. The SNP markers were identified in 13 ESTs that showed similarity to stress response, development and latex biosynthesis proteins. Six sequences were highly abundant in the cold exposure libraries and expression analyses demonstrated that five sequences were up-regulated during the exposure, with emphasis to two sequences with more than 70-fold increase in expression. From the developed EST-SSRs, 46 were genotyped in the segregating F1 population comprised of 270 plants. These markers were added to the genetic map, which know contains a total of 330 markers. The OneMap software was used for the map construction that now has 3,068.9 cM and 22 linkage groups. Five loci were mapped into QTLs, and transcripts of three of them present similarity to proteins involved in stress response and developmental processes. These loci may be candidate genes for studies related to rubber tree growth traits. To our knowledge, this is the first work in rubber tree that combines analyses of ESTs from different tissues and treatments, and to analyze sequences under cold stress, in several H. brasiliensis genotypes. The new positioned markers may help in the identification of genes of interest and QTLs for other agronomic important traits. The several gene-targeted markers developed here will be used in the mapping and positioning of possible genes in other mapping populations that are now being evaluated at Genetics and Molecular Analysis Laboratory