Orientador: Kleber Gomes Franchini

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A proteína Focal Adhesion Kinase (FAK; PTK2) participa de vários processos celulares. A identificação das proteínas parceiras de FAK tem contribuído para o entendimento de suas múltiplas funções celulares. Utilizando um sistema de indução de FAK fusionada a uma cauda de FLAG, combinada com...

Resumo: A proteína Focal Adhesion Kinase (FAK; PTK2) participa de vários processos celulares. A identificação das proteínas parceiras de FAK tem contribuído para o entendimento de suas múltiplas funções celulares. Utilizando um sistema de indução de FAK fusionada a uma cauda de FLAG, combinada com análises por espectrometria de massas (MS), identificamos proteínas associadas à FAK em células HEK293. Um total de 153 proteínas foram repetidamente identificadas com alta resolução por experimentos de MS. Além de confirmar interações já previamente descritas como Paxillin (PXN), Heat shock protein Hsp90 (HSP90) e Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGF?1I1), as análises por MS revelaram um novo conjunto de proteínas associadas à FAK, incluindo proteínas envolvidas nas vias de síntese de proteínas, expressão gênica, crescimento celular, proliferação, morte e sobrevivência celular. Além disso, análises de bioinformática das vias indicaram que a FAK se associa com um conjunto de 30 proteínas envolvidas com a via de modificação pós-transcricional do RNA, incluindo a proteína Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), que é um marcador de speckles nucleares. Esse conjunto de proteínas está associado ao spliceossomo e um conjunto similar de proteínas também foi identificado com os experimentos que utilizaram somente o domínio FERM da FAK. Validações por Western Blotting e imunocitoquímica demonstraram que FAK se associa e co-localiza com a proteína SC-35 no núcleo celular. Ainda identificamos um papel funcional da FAK no splicing do mRNA. Demonstramos que FAK pode modificar o padrão de splicing de um gene repórter E1A ao ser superexpressa em células HEK. Nosso trabalho propõe novas funções da FAK no núcleo, indicando que esta pode estar envolvida em eventos relacionados à função do RNA, como a regulação do splicing do mRNA

Abstract: Focal adhesion kinase (FAK; PTK2) has roles in many cellular processes. The identification of protein partners for FAK has greatly contributed to our understanding of its multiple function. Using inducible FLAG-tagged FAK combined with affinity/purification mass spectrometry (MS) approach,...

Abstract: Focal adhesion kinase (FAK; PTK2) has roles in many cellular processes. The identification of protein partners for FAK has greatly contributed to our understanding of its multiple function. Using inducible FLAG-tagged FAK combined with affinity/purification mass spectrometry (MS) approach, we identified proteins associated with FAK in HEK293 cells. A total of 153 proteins were repeatedly detected in high-resolution MS measurements. Beyond the well characterized partnering with Paxillin (PXN), Heat Shock protein 90 (HSP90) and Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGFB1I1), analysis of MS data uncovered novel sets of proteins that associate with FAK, playing a role in protein synthesis, gene expression, cellular growth, proliferation, death and survival. In addition, the network analysis established the unexpected finding that a module of 30 proteins linked to RNA post-transcriptional modifications are recruited by FAK, including Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), which is a marker of the nuclear speckles. Indeed, this module is found to be enriched by proteins associated with spliceosome. Remarkably, a similar set of proteins was also recruited by FAK N-terminal FERM domain. Biochemical and imunofluorescence validations established that FAK associates and co-localizes with SC-35 protein at the cell nuclei. We further pinpoint a functional role of FAK in mRNA splicing. We showed that FAK can modify the splicing site selection of the adenoviral E1A minigene in a dose-dependent manner. Our work provides new insights into the molecular function of FAK in the nucleus, indicating that it may be involved in events related to RNA function, such as pre-mRNA splicing