Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira

Texto em português e inglês

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A completa utilização da biomassa lignocelulósica é um dos pré-requisitos para tornar o processo do etanol de segunda geração economicamente competitivo. Entretanto, a fermentação dos açúcares disponíveis na biomassa celulósica apresenta um desafio único em decorrência da presença de outros...

Resumo: A completa utilização da biomassa lignocelulósica é um dos pré-requisitos para tornar o processo do etanol de segunda geração economicamente competitivo. Entretanto, a fermentação dos açúcares disponíveis na biomassa celulósica apresenta um desafio único em decorrência da presença de outros açúcares, além da glicose, tais como xilose e arabinose, os quais não são fermentáveis por Saccharomyces cerevisiae, a principal levedura utilizada na indústria. Em leveduras, a conversão de D-xilose a D-xilulose ocorre em duas etapas: inicialmente D-xilose é reduzida a D-xilitol pela enzima xilose redutase (XR); em seguida, D-xilitol é oxidado a D-xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH). Em S. cerevisiae, essas duas enzimas possuem cofatores distintos, provocando assim um desequilíbrio redox na célula, impedindo a utilização anaeróbica de pentoses. Uma alternativa para que S. cerevisiae possa produzir etanol através destes açúcares é modificá-la geneticamente com genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizem esta conversão. Dessa forma, este projeto isolou e caracterizou as leveduras Rhodotorula dairenensis TAB01 e Pseudozyma brasiliensis sp.nov. GHG001, a partir do intestino de insetos parasitas da cana-de-açúcar, através da análise de expressão dos genes xyl1 e xyl2 que codificam, respectivamente, as enzimas XR e XDH. Adicionalmente, foi avaliada a hiper-expressão destes na cepa industrial de S. cerevisiae PE-2 e na cepa PE-2 super-expressando o gene XKS1 de S. cerevisiae (PE-XKS), o qual codifica a enzima xilulose quinase (XK). P. brasiliensis GHG001 e R. dairenensis TAB01 mostraram-se promissoras para o estudo. Estas duas espécies são ótimas assimiladoras de xilose e seus genes de XR e XDH foram expressos heterologamente em S. cerevisiae, gerando as cepas PE Rd, PE Pb, PE-XKS Rd e PE-XKS Pb, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Porém, essas cepas recombinantes não conseguiram utilizar xilose como única fonte de carbono, o que evidencia o quão importante é o desbalanço de cofatores das enzimas no metabolismo de xilose. Além disso, devido a uma notável importância biotecnológica, também foi caracterizada uma enzima xilanolítica produzida por P. brasiliensis GHG001 a qual apresentou uma alta atividade xilanolítica. Essa xilanase, pertencente à família GH11, apresentou pH e temperatura ótimos iguais a 4 e 55°C, respectivamente, sendo sua estrutura secundária constituída de folhas beta. A sua atividade enzimática é influenciada por alguns íons como Ca2+ e os resultados de sua cinética indicaram um comportamento sigmoidal característico de enzimas alostéricas. Usando xilano como substrato, esta xilanase produz xilooligossacarídeos que podem ser usados industrialmente como prébióticos, que junto a outras aplicabilidades desta enzima na indústria, demonstram seu alto potencial biotecnológico

Abstract: Full utilization of lignocellulosic biomass is one of the prerequisites to make the process of second generation ethanol economically competitive. However, the fermentation of sugars available in cellulosic biomass presents a unique challenge due to the presence of other sugars besides...

Abstract: Full utilization of lignocellulosic biomass is one of the prerequisites to make the process of second generation ethanol economically competitive. However, the fermentation of sugars available in cellulosic biomass presents a unique challenge due to the presence of other sugars besides glucose, such as xylose and arabinose, which are not fermentable by Saccharomyces cerevisiae, the main yeast used in the industry. In yeasts, the conversion of D-xylose to D-xylulose occurs in two steps: first D-xylose is reduced to xylitol by the enzyme D-xylose reductase (XR), and then D-xylitol is oxidized to D-xylulose by the enzyme xylitol dehydrogenase (XDH). In S. cerevisiae, these two enzymes have different cofactors, thereby causing a redox imbalance in the cell, preventing the use of pentoses anaerobically. An alternative to S. cerevisiae can produce ethanol by these sugars is genetically modifying it with genes derived from microorganisms that naturally carry out this conversion. Thus, this project characterized the yeasts Rhodotorula dairenensis TAB01 and Pseudozyma brasiliensis GHG001, isolated from the gut of insects pests of sugarcane, through the analysis of genes expression of xyl1 and xyl2 which encoding respectively, the XR and XDH enzymes and measured the enzymatic activity of the same. Additionally, was evaluated the overexpression of these in S. cerevisiae industrial strains PE-2 and PE-2 XKS1 overexpressing xks1 gene of S. cerevisiae, which encodes the enzyme xylulokinase (XK). P. brasiliensis GHG001 and R. dairenensis TAB01 shown promise for this study as they are great xylose assimilators and their assimilating xylose genes are expressed in the presence of this sugar. XR and XDH were heterologously expressed in S. cerevisiae, generating strains Rd PE, PE Pb, PE-XKS Rd and PE-XKS Pb, which were tested for the ability to utilize xylose for growth. However, these recombinant strains were unable to utilize xylose as sole carbon source, which shows how important is the imbalance of cofactors of the metabolize xylose enzymes. Moreover, due to a remarkable biotechnological importance, has also been characterized a xylanolytic enzyme produced by P. brasiliensis GHG001 which showed a high activity, yet unreported by other eukaryotic microorganism. This xylanase belonging to family GH11, showed pH and temperature optima equal to 4 and 55°C, respectively, and its secondary structure consists of ?-sheets. This enzyme has influence of some ions such as Ca2+ and showed a sigmoidal kinetic behavior, characteristic of allosteric enzymes. From xylan, the xylanase produces xylooligosacharides which can be used industrially as prebiotics, which together with other applicability of this enzyme in the industry, demonstrate their high biotechnological potential