Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária que resulta de uma mutação no gene da globina beta. Essa mutação leva a formação de uma hemoglobina (Hb) com propriedades físico-químicas anormais, denominada HbS. A vaso-oclusão é a principal complicação aguda e a principal causa...

Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária que resulta de uma mutação no gene da globina beta. Essa mutação leva a formação de uma hemoglobina (Hb) com propriedades físico-químicas anormais, denominada HbS. A vaso-oclusão é a principal complicação aguda e a principal causa de morbidade da doença falciforme, compreendendo um processo multicelular que parece ser iniciado pela adesão de hemácias e leucócitos ao endotélio ativado, causando a obstrução vascular e isquemia tecidual. A adesão de hemácias ao endotélio contribui para a redução do fluxo sanguíneo na AF, entretanto, leucócitos também parecem exercer um papel fundamental neste processo, pois são células maiores, menos flexíveis e seu recrutamento para a microvasculatura e subsequente interação com as células circulantes sanguíneas promove a redução do fluxo sanguíneo nos vasos. Assim, investigações na dinâmica de interações heterocelulares são áreas potencialmente atrativas para pesquisa, pois elas podem contribuir para melhorar o entendimento de mecanismos de inflamação vascular e para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para doenças como a AF. O objetivo deste projeto foi estudar as interações heterotípicas dos neutrófilos a plaquetas, células vermelhas e células endoteliais em células de pacientes com AF e as moléculas de adesão celular envolvidas nestas interações, utilizando uma plataforma microfluidica (quantifica adesão celular em fluxo em biochips com canais paralelos), citometria de fluxo com imagem (imagem simultânea das células obtidas pelo citômetro) e o desenvolvimento de um biochip para estudo dos processos vaso-oclusivos (para utilização na plataforma microfluídica). Sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles) e pacientes com anemia falciforme (em uso ou não da terapia de hidroxiureia ¿ HU) foi coletado e os experimentos realizados. Observamos que células vermelhas de pacientes AF sem uso da HU aderem mais, quando em fluxo, à laminina e interagem mais aos neutrófilos autólogos aderidos ao endotélio ativado. Quando avaliada a participação das principais moléculas de adesão expressas no endotélio, E-selectina e ICAM-1, na promoção das interações de eritrócitos a neutrófilos aderidos, observamos que a duração destas interações heterotípicas, em células provenientes dos pacientes AF, é mais prolongada na presença do ligante E-selectina. Neutrófilos de pacientes com AF também circulam mais em agregados a plaquetas ou células vermelhas no sangue periférico, comparados aos neutrófilos de indivíduos saudáveis. Os reticulócitos demonstraram ser o principal tipo de eritrócito envolvido nos agregados de neutrófilos circulantes e os níveis de hemoglobina fetal correlacionaram-se inversamente à porcentagem encontrada de agregados de neutrófilo-reticulócito no sangue periférico destes pacientes. As plaquetas demonstraram papel de destaque na formação e participação nos agregados circulantes de neutrófilos a células vermelhas e experimentos utilizando anticorpos bloqueadores ou inibidor, indicaram que as moléculas de adesão P-selectina, na plaqueta, Mac-1 no neutrófilo, VLA-4 nos reticulócitos e ICAM-4 nas hemácias podem ser as responsáveis pela interação dos neutrófilos a estas células. Neutrófilos de pacientes AF também obstruíram significativamente mais os microcanais com diâmetros de 25 a 40µm do biochip desenvolvido por nós para estudar os processos vaso-oclusivos, comparados aos neutrófilos de indivíduos controle. Quando misturamos suspensões de neutrófilos a eritrócitos, observamos uma obstrução ainda maior destes microcanais. Diante destes resultados, é possível concluir que neutrófilos de pacientes AF interagem significativamente mais às células vermelhas quando aderidos ao endotélio, circulam agregados a eritrócitos e plaquetas no sangue, além de possuírem maior capacidade de obstrução in vitro em microcanais que mimetizam vênulas de pequeno calibre. A terapia com HU parece afetar apenas as interações de neutrófilo na presença do endotélio vascular. Terapias que visem à inibição das moléculas de adesão Mac-1 e P-selectina na patologia da anemia falciforme parecem ser promissoras

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary hemoglobinopathy that results from a mutation in the beta globin gene. This mutation leads to the formation of an abnormal hemoglobin (Hb), known as HbS. Vaso-occlusion is the major acute complication and the major cause of morbidity in SCA; it...

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary hemoglobinopathy that results from a mutation in the beta globin gene. This mutation leads to the formation of an abnormal hemoglobin (Hb), known as HbS. Vaso-occlusion is the major acute complication and the major cause of morbidity in SCA; it comprises a multicellular process that appears to be initiated by the adhesion of red blood cells (RBCs) and leukocytes to the activated endothelium, causing vascular obstruction and tissue ischemia. The adhesion of sickle RBCs to the endothelium contributes to decrease blood flow; however, leukocytes also seem to play a key role in this process as these cells are bigger, less flexible and their recruitment to the microvasculature and subsequent interaction with circulating blood cells promotes reduced blood flow in vessels. Research into the dynamics of heterocellular interactions is a potentially attractive area of research, since such data may improve our understanding of the mechanisms involved in vascular inflammation and contribute to the development of new therapeutic targets in diseases such as SCA. The aim of this project was to study the heterotypic interactions of neutrophils with platelets, red cells and endothelial cells in cells from SCA individuals and the possible adhesion molecules involved in these interactions, using microfluidic techniques (cell adhesion flow in biochips with parallel channels), imaging flow cytometry (simultaneous imagery of cells acquired by flow cytometry) and the development of a biochip for the study of vaso-occlusive processes (for use in conjunction with the microfluidic platform). Peripheral blood from healthy individuals (controls) and sickle cell anemia patients (with or without hydroxyurea therapy - HU) were collected and the experiments were performed. RBCs from SCA patients without HU were observed to adhere more, under flow, to laminin-coated biochips and they interact more with autologous neutrophils previously adhered to an activated endothelium. When evaluating the participation of the two main adhesion molecules expressed on activated endothelium, E- selectin and ICAM-1, in promoting interactions of RBCs to adherent neutrophils, we found that the duration of these heterotypic interactions for cells from SCA patients was longer in the presence of E-selectin ligand. Neutrophils from SCA patients also circulate aggregated to platelets or RBCs in the peripheral blood significantly more than the neutrophils of healthy individuals. Reticulocytes were the main RBC type involved in these neutrophil-RBC aggregates and the levels of fetal hemoglobin were inversely correlated to the percentage of the neutrophil- reticulocyte aggregates found in the peripheral blood of these patients. Platelets demonstrated a prominent role in the formation of the circulating neutrophil-RBCs aggregates, and function-blocking antibodies or inhibitors indicated that the adhesion molecules P-selectin, on platelets, Mac-1, on neutrophils, VLA-4, on reticulocytes, and ICAM-4, on mature erythrocytes, may be responsible for the interactions of neutrophils with these cells. Neutrophils from SCA patients also demonstrated a significant capacity to obstruct microchannels with diameters of between 25 and 40?m, of the biochip developed by us to study vaso-occlusive processes, compared to the cells from control subjects. When mixed suspensions of neutrophils and autologous RBCs were applied to the chips, we observed an even greater obstruction of these microchannels. In summary, we conclude that SCA neutrophils interact significantly more with red cells when adhered to endothelial cells, circulate aggregated to erythrocytes in the peripheral blood of these patients, and present a greater capacity to obstruct microchannels that mimic small venules in vitro. HU therapy appears to affect only neutrophil interactions in the presence of the vascular endothelium. Therapies that target molecules such Mac-1 and P-selectin in sickle cell disease seem to be promising strategies