Orientador: Ladaslav Sodek

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A soja é uma leguminosa amplamente utilizada para estudos envolvendo a fixação biológica de Nitrogênio (N), seja por sua grande importância econômica, seja por sua elaborada e bem sucedida relação simbiótica com rizóbios do gênero Bradyrhizobium, sendo capaz de obter todo N necessário para...

Resumo: A soja é uma leguminosa amplamente utilizada para estudos envolvendo a fixação biológica de Nitrogênio (N), seja por sua grande importância econômica, seja por sua elaborada e bem sucedida relação simbiótica com rizóbios do gênero Bradyrhizobium, sendo capaz de obter todo N necessário para seu desenvolvimento através da fixação do N2 atmosférico. Todavia, o metabolismo de N em plantas de soja noduladas é sensível à hipóxia provocada pelo alagamento do sistema radicular. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo, avaliar os efeitos do alagamento sobre o metabolismo de N em nódulos de soja em diferentes períodos de inundação e recuperação após a drenagem. Para isto, plantas de soja noduladas com o B. elkanii foram submetidas aos experimentos de inundação e recuperação, sendo os períodos de inundação/recuperação variáveis de acordo com o experimento. As alterações no metabolismo foram avaliadas através da análise da composição de aminoácidos por HPLC e avaliação da incorporação de 15N2 nos aminoácidos dos nódulos. Também foi avaliada a atividade da nitrogenase e a expressão dos genes nifH e nifD (nitrogenase), e dos genes que codificam as enzimas glutamato descarboxilase (GAD) e asparagina sintetase (AS) em soja. Verificamos que asparagina (ASN) é o aminoácido mais abundante em nódulos de soja (50%), seguido por glutamato (GLU), serina (SER) e ácido gama-aminobutírico (GABA). Com a inundação observou-se principalmente, uma redução acentuada de ASN, e aumento de GABA, após 4 dias (quando ASN reduziu a quase 1%), além de pequenas alterações na composição de outros aminoácidos. Com os tratamentos de recuperação ASN recuperou-se lentamente e quanto maior o período de exposição ao estresse mais lento o período de recuperação. Aparentemente a redução de ASN nos nódulos foi compensada pelo aumento de GABA. A atividade da nitrogenase foi fortemente inibida pela inundação, mas se recuperou totalmente. Quanto à incorporação de 15N2, verificamos que GLN foi o aminoácido marcado em grau mais elevado, seguido respectivamente por GLU, ASP, ALA e SER. A marcação dos aminoácidos ASN e GABA foi baixa, e isso pode ser devido ao grande "pool" destes aminoácidos no nódulo, ou pela entrada destes aminoácidos a partir de uma fonte não-marcada como o floema. Com relação à inundação, observou-se uma redução na incorporação de 15N2 em ASN, e a recuperação também foi lenta, também houve redução na incorporação em outros aminoácidos como ASP e GLN. A hipóxia afetou a expressão dos genes avaliados nos nódulos. Houve uma redução na expressão dos genes AS1 e AS2, o que condiz com a redução nos teores de ASN. O gene que codifica a GAD também foi menos expresso em nódulos submetidos à inundação o que não explica o aumento de GABA no nódulo durante o estresse. A expressão dos genes nifH e nifD também diminuiram com a inundação, mas se recuperam, e condizem com o observado para atividade da nitrogenase. Dessa forma, verificamos que a inundação afeta o metabolismo de N nos nódulos de soja, em diversos aspectos, como a composição de aminoácidos, atividade da nitrogenase e na expressão de genes envolvidos na assimilação do N em aminoácidos nos nódulos

Abstract: Soybean has been widely used in studies of biological nitrogen fixation, not only because of its economic importance, but in view of its highly efficient symbiotic relationship with rhizobia of the genus Bradyrhizobium, which can supply all the N needed for full development of the plant....

Abstract: Soybean has been widely used in studies of biological nitrogen fixation, not only because of its economic importance, but in view of its highly efficient symbiotic relationship with rhizobia of the genus Bradyrhizobium, which can supply all the N needed for full development of the plant. However, the process is highly sensitive to oxygen deficiency provoked by waterlogging of the root system, resulting in a rapid and strong inhibition of nitrogen fixation since the availability of oxygen for nitrogenase activity is tightly controlled in the nodule and close to limiting under normal conditions. Thus, this study aimed to evaluate the effects of flooding on the N metabolism in nodules of soybean in different periods of flooding and recovery after drainage. For this, soybean plants nodulated with B. elkanii were subjected to flooding and recovery experiments at stages V7/V8 The flooding/recovery duration was where the flooding/recovery periods were variable according to the experiment. Changes in metabolism were evaluated by analyzing the amino acid composition by HPLC and by assessing the amino acid incorporation of 15N2 of the nodules. Nitrogenase activity and expression of nifH and nifD (nitrogenase) genes, and genes encoding GAD and AS in soybean were also evaluated. The most abundant amino acid in soybean nodules was asparagine (ASN) (50%), followed by glutamate (GLU), serine (SER) and gama-aminobutyric acid (GABA). On flooding, there was a marked decrease of ASN, and increased GABA, mainly after 4 days when ASN dropped to near 1%, as well as smaller alterations in the composition of other amino acids. With the recovery treatments, ASN recovered slowly and the longer the period of exposure to the stress the longer the recovery period. It appears that the reduction of the ASN in nodules is compensated by the increase of GABA. The nitrogenase activity was strongly inhibited by flooding, but full recovery was possible. Regarding the incorporation of 15N2, it was found that GLN is the amino acid labelled to the highest degree, followed respectively by GLU, ASP, ALA and SER. The labelling of the amino acids GABA and ASN was low, which may be due either to the large pool of these amino acids in the nodule, or to the entry of these amino acids from a non-labelled source such as the phloem. Flooding resulted in a reduction of the incorporation of 15N2 in ASN, and recovery was also slow. There was also reduction in the incorporation of 15N2 in other amino acids, such as Asp and GLN. Hypoxia affected the expression of all genes evaluated in nodules. There was a reduction in the expression of the AS1 and AS2 genes, which is consistent with the fall in levels of ASN. Recovery of expression was slow and gradual. Expression of the gene encoding the enzyme GAD was also strongly suppressed in nodules under flooding which does not therefore explain the increase of GABA in the nodule during stress. The expression of nifH and nifD genes were also strongly decreased on flooding, but recovered fully, consistent with the observed data for nitrogenase activity. In conclusion, it was found that flooding affects the metabolism of N in soybean nodules, in diverse ways, such as the amino acid composition, nitrogenase activity, and the expression of genes involved in N assimilation of nodule amino acids