Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

Texto em português e inglês

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: O principal fator de virulência das bactérias Gram-negativas é representado pela liberação de seus subprodutos [Lipopolissacarídeos (LPS) ¿ endotoxinas] presentes na membrana externa do envelope celular bacteriano. O acumulo destes componentes bacterianos no canal radicular e a sua saída...

Resumo: O principal fator de virulência das bactérias Gram-negativas é representado pela liberação de seus subprodutos [Lipopolissacarídeos (LPS) ¿ endotoxinas] presentes na membrana externa do envelope celular bacteriano. O acumulo destes componentes bacterianos no canal radicular e a sua saída para os tecidos periapicais estimula o sistema imune do hospedeiro produzindo uma reação antígeno-anticorpo que gera uma resposta inflamatória a nível periapical. Esta reação é caraterizada pela expressão de mediadores químicos e enzimas, tais como as citocinas pró-inflamatórias e as metaloproteinases (MMPs). Assim, foram objetivos do presente estudo: 1) avaliar a influência do conteúdo infeccioso diante as diferentes etapas do tratamento endodôntico de dentes com infecção primária, na resposta imune do hospedeiro para a produção de interleucina 1 alfa (IL-1?), 1 beta (IL-1?), fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), prostaglandina E2 (PGE2), MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 correlacionando esses níveis com os sinais e sintomas clínicos (capitulo 1); 2) avaliar o efeito da ativação do EDTA 17% com ultrassom na redução do conteúdo infeccioso de dentes com infecção primária (capitulo 2); 3) investigar os níveis de endotoxinas de dentes com infecção primária, antes e após o preparo químico-mecânico (PQM) e determinar seu potencial antigênico contra fibroblastos 3T3 através da atividade gelatinolítica de MMPs (capitulo 3). Método: Foram selecionados 24 pacientes com necessidade de intervenção endodôntica por necrose do tecido pulpar e presença de lesão periapical. Amostras do conteúdo do canal radicular foram coletadas antes do PQM (S1), depois do PQM (S2) e depois do uso de EDTA 17% (S3) com e sem ativação com ultrassom (G1 e G2, respectivamente). Amostras para quantificação de citocinas e MMPs foram coletadas passando um cone de papel 2 mm além do ápice radicular depois do PQM. As amostras microbiológicas foram processadas por cultura para contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) e identificação. PCR foi realizado utilizando primers espécie-específicos. As amostras de LPS foram analisadas pelo método Limulus Amoebocyte Lysate (LAL). As coletas de citocinas e MMPs foram quantificadas utilizando kits específicos pelo ensaio imunoenzimático de absorção (ELISA). A atividade gelatinolítica foi avaliada por zimografia. Os níveis de produção das citocinas e MMPs foram correlacionados individualmente com os sinais e sintomas clínicos [dor à percussão (POP), dor à palpação (TOP), presença de exudato (EX)]. O teste de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre endotoxinas e a produção de citocinas e MMPs. Os testes de Friedman e Wilcoxon compararam os níveis de endotoxina e carga microbiana em cada tempo operatório. Os dados obtidos pela atividade gelatinolítica foram analisados pelos testes de ANOVA e Tuckey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). Resultados: IL-1?, IL-1?, TNF-?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 foram detectados em todas as amostras. Foi encontrada correlação positiva entre os níveis de endotoxinas e de todas as citocinas e MMPs avaliadas (p<0,05). EX foi correlacionado positivamente com TNF-?, enquanto os níveis de IL-1?, PGE2 e MMP-8 foram correlacionados com sintomatologia dolorosa (POP/TOP) (p<0,05). O PQM reduziu significativamente os níveis de endotoxina e da carga bacteriana (p<0,05). Maiores níveis de redução de endotoxinas foram registrados quando a irrigação com EDTA foi ativada com ultrassom. Não foram encontradas diferenças significativas na redução da carga bacteriana entre G1(99.98%) e G2 (99.93%) (p>0,05). Foi encontrada correlação entre os níveis de entotoxinas (S1) e a expressão de MMP-2 por fibroblastos. Não foi observada atividade gelatinolítica para MMP-9. Conclusão: 1) O conteúdo infeccioso/endotóxico é um potente estímulo para a resposta imune do hospedeiro na produção de IL-1?, IL-1?, TNF?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13. 2) O PQM consegue reduzir significativamente a carga microbiana e os níveis de endotoxinas. Adicionalmente, a ativação do EDTA com ultrassom promove uma redução maior dos níveis residuais de endotoxinas. 3) O conteúdo infeccioso/endotóxico é um potente estímulo para a expressão gênica de MMP-2 por fibroblastos 3T3

Abstract: Lipopolysaccharides (LPSs, known as endotoxins) present on the outer layers of Gram-negative bacterial envelope, and released during bacteria multiplication and death, can egress into periradicular tissues, acting as one of the most potent stimuli for immunocompetent cells in the release...

Abstract: Lipopolysaccharides (LPSs, known as endotoxins) present on the outer layers of Gram-negative bacterial envelope, and released during bacteria multiplication and death, can egress into periradicular tissues, acting as one of the most potent stimuli for immunocompetent cells in the release of inflammatory mediators and matrix metalloproteinases (MMPs). Thus, the objectives of this study were: 1) To evaluate the influence of primarily infected root canal contents (bacterial and endotoxin contents) on host-immune response by interleukin (IL)-1?, IL-1?, tumor necrosis factor ? (TNF-?), prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinases (MMP) MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13 production and to correlate their levels with clinical features (chapter 1); 2) To investigate the influence of 17% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ultrasonic activation after chemo-mechanical preparation (CMP) on eliminating/reducing oral bacterial lipopolysaccharide (LPS, known as endotoxins) and cultivable bacteria in teeth with pulp necrosis and apical periodontitis (chapter 2); 3) To investigate the endotoxin levels from primary endodontic infection before and after CMP, and to determine their antigenicity against 3T3 fibroblasts through gelatinolytic activity of MMPs (chapter 3). Methods: Root canal content samples were taken from 24 primarily infected root canals with apical periodontitis by using sterile/apyrogenic paper points. Samples were taken at different clinical times: S1- before CMP; S2- after CMP; S3- after EDTA: G1- with ultrasonic activation (n=12) and G2- without ultrasonic activation (n=12). PCR technique (16S rRNA) was used for the detection of the target bacteria. Culture techniques were used to determine the number of colony-forming units (CFU). Limulus Amebocyte Lysate (LAL) was used to measure endotoxin. Cytokines and MMPs levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from samples that were taken passing 2 mm through the root apex after CMP. The levels of MMP-2 and MMP-9 gelatinolytic activity were measured using the zymography technique. The Pearson coefficient was used to correlate the amount of endotoxins with cytokine and MMP levels. Clinical data were set as dependent variables and correlated by individual correlation with each cytokine and MMP level. Friedman¿s and Wilcoxon tests was used to compare the amount of bacteria and endotoxin contents at each clinical time. Data obtained from gelatinolytic activity was analysed using Anova and Tukey¿s tests. The significance levels always were set at 5% (p<0,05). Results: IL-1?, IL-1?, TNF-? and PGE2, as well as, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13 were detected in all samples. A correlation between endotoxin levels with cytokines and MMPs production was found (p<0.05). Root canal exudation was positively correlated with high levels of TNF-?, and symptomatic teeth were correlated with IL-1?, PGE2 and MMP-8 (p<0.05). CMP were effective in reducing endotoxins and bacterial load (p<0.05). Higher values of endotoxin reduction were achieved when EDTA received ultrasonic activation compared with the no-activation group (p<0.05). No differences were found in the bacterial load reduction after EDTA when comparing G1 (99.98%) and G2 (99.93%) (p>0.05). A correlation was found between the levels of endotoxins and MMP-2 expression (p<0.05). No gelatinolytic activity of MMP-9 was observed. Conclusion: 1) Primarily infected root canal infection contents are potent stimuli factor for host-immune response by the production of IL-1?, IL-1?, TNF-?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13. 2) Although CMP was effective in reducing bacteria and endotoxins, it was not able to eliminate them from all root canals analyzed. The ultrasonic activation of EDTA was efficient in reducing even more the endotoxins levels in the root canals of teeth with pulp necrosis and apical periodontitis. 3) Root canal content from primary endodontic infection showed gelatinolytic activity for MMP-2