Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A agamaglobulinemia ligada ao X (XLA; OMIM#300755) é caracterizada por um bloqueio na diferenciação dos linfócitos B na medula óssea, levando à profunda hipogamaglobulinemia e reduzido número ou ausência de linfócitos B periféricos. Os pacientes são susceptíveis a infecções recorrentes por...

Resumo: A agamaglobulinemia ligada ao X (XLA; OMIM#300755) é caracterizada por um bloqueio na diferenciação dos linfócitos B na medula óssea, levando à profunda hipogamaglobulinemia e reduzido número ou ausência de linfócitos B periféricos. Os pacientes são susceptíveis a infecções recorrentes por bactérias encapsuladas e enterovírus. XLA é causada por mutações no gene da tirosina quinase de Bruton (BTK). Contudo, não há estudos de relação entre expressão protéica e o tipo de mutação, nem sobre as conseqüências da retenção intracelular do excesso de proteínas mal formadas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BTK e sua relação com o tipo de mutação em pacientes com XLA, assim como verificar suas conseqüências nos sensores de estresse do retículo endoplasmático. O diagnóstico de XLA foi baseado em infecções recorrentes, níveis significativamente reduzidos de IgM, IgG e IgA, linfócitos B circulantes <2% e mutação identificada no gene BTK. A expressão dos transcritos de BTK foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real em oito pacientes XLA e oito controles. Pela mesma técnica, foi avaliada a expressão de 10 genes do estresse do retículo endoplasmático em seis pacientes e seis controles. Foram caracterizadas quatro mutações missense, uma mutação nonsense, dois frameshifts e um defeito em sítio de splicing. As mutações do tipo nonsense, frameshift e defeito em sítio de splicing levaram à formação de stop codon prematuro. Foi detectado um perfil de expressão de BTK diferenciado nos pacientes com mutações com stop codon prematuro em comparação aos pacientes com mutações missense e controles saudáveis. Especificamente, os pacientes com mutações com stop codon prematuro apresentaram redução da expressão de BTK (P = 0,004). No entanto, verificamos que as mutações missense não afetaram a expressão de BTK. Por meio de imunocitoquímica, encontramos que as mutações com stop codon prematuro levaram à deficiência da expressão da proteína BTK e as do tipo missense resultaram na localização anormal da proteína no citoplasma celular, o que evidencia a síntese de proteína não funcional. Os pacientes com XLA apresentaram expressão aumentada do marcador de estresse do retículo endoplasmático XBP1 (P = 0,002). Em conclusão, a quantificação da expressão de mRNA para BTK é uma ferramenta para diferenciar as conseqüências mutacionais em pacientes com XLA. Ela também pode contribuir para o estudo de transcritos em outras doenças genéticas com diferentes tipos de mutação. Este é o primeiro relato de estresse do retículo endoplasmático na agamaglobulinemia ligada ao X

Abstract: X-linked agammaglobulinemia (XLA, OMIM # 300755) is characterized by a block in differentiation of B lymphocytes in the bone marrow, leading to profound hypogammaglobulinemia and few or no peripheral B lymphocytes. Patients are susceptible to recurrent infections by encapsulated bacteria...

Abstract: X-linked agammaglobulinemia (XLA, OMIM # 300755) is characterized by a block in differentiation of B lymphocytes in the bone marrow, leading to profound hypogammaglobulinemia and few or no peripheral B lymphocytes. Patients are susceptible to recurrent infections by encapsulated bacteria and enteroviruses. XLA is caused by mutations in the Bruton tyrosine kinase gene (BTK). However, there have been no studies on the relationship between protein expression and the type of mutation, nor on the consequences of the disruption of protein folding that results in intracellular retention. The objectives of this study were to evaluate BTK expression and its mutation type in patients with XLA, as well as to verify their consequences on the endoplasmic reticulum stress sensors. The XLA diagnosis was based on recurrent infections, significantly reduced levels of IgM, IgG and IgA, circulating B lymphocytes <2% and BTK gene mutation identified. The expression of BTK transcripts was assessed by quantitative real-time PCR in eight XLA patients and eight control subjects. By the same technique, the expression of 10 endoplasmic reticulum stress genes was measured in six patients and six controls. Four missense mutations, one nonsense mutation, two frameshifts and a splice site defect were characterized. Mutations of the nonsense type, frameshift and splice site defect led to a premature stop codon formation. A differential profile of expression of BTK was detected in patients with mutations that led to a premature stop codon compared to patients with missense mutations and healthy controls. Specifically, patients with mutations resulting in a premature stop codon exhibited reduced expression of BTK gene (P = 0.004). However, it was found that missense mutations did not affect BTK expression. By immunocytochemistry, we found that mutations with a premature stop codon impaired expression of BTK protein and that missense mutations led to an abnormal localization of the protein in the cell cytoplasm, showing the synthesis of a non-functional protein. Patients with XLA showed increased expression of the endoplasmic reticulum stress marker XBP1 (P = 0.002). In conclusion, the quantification of mRNA expression for BTK is a tool to differentiate mutational consequences in patients with XLA. It can also contribute to the study of transcripts in other genetic diseases with different types of mutation. This is the first report on endoplasmic reticulum stress in X-linked agammaglobulinemia