Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Karina Gottardelo Zecchin

Texto em português e inglês

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Recentemente mostramos que os inibidores da enzima ácido graxo sintase (FASN - EC 2.3.1.85), cerulenina e orlistat, reduzem a proliferação e induzem apoptose em células B16-F10 de melanoma murino via mecanismos mitocondriais. Neste presente estudo investigamos os efeitos desses inibidores de...

Resumo: Recentemente mostramos que os inibidores da enzima ácido graxo sintase (FASN - EC 2.3.1.85), cerulenina e orlistat, reduzem a proliferação e induzem apoptose em células B16-F10 de melanoma murino via mecanismos mitocondriais. Neste presente estudo investigamos os efeitos desses inibidores de FASN em linhagem celular não-tumorigênica derivada de melanoblastos de camundongos (melan-a). O tratamento in vitro de células melan-a com 5 µg/mL de cerulenina ou com 30 µM de orlistat inibiu a proliferação celular, com acúmulo da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1, assim como induziu a via intrínseca da apoptose com liberação de citocromo c e ativação de caspases-3 e -9, sem ativação da caspase-8. Os inibidores de FASN não alteram o conteúdo de ácidos graxos livres nas células melan-a, verificados por espectrometria de massas, sugerindo que o tratamento com cerulenina ou orlistat induz apoptose independente da inibição desta enzima. Análise das funções da bioenergética mitocondrial das células melan-a mostraram inibição da respiração, seguido por aumento da produção de superóxido. A inibição da respiração, promovida pelo tratamento com cerulenina ou orlistat, foi restrita à oxidação de substratos ligados a NADH (39,9% DMSO x cerulenina; ou 60,8% EtOH x orlistat) e succinato (45,8% DMSO x cerulenina; ou 51,8% EtOH x orlistat), e não foi significativa quando as mitocôndrias estavam respirando com substrato do complexo IV, N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina. A proteção conferida pelo sequestrador de radicais livres N-acetil cisteína (NAC) sugere que a disfunção mitocondrial provocada por estes compostos está associada a estresse oxidativo e é provável que seja mediada pela ação de superóxido na cadeia respiratória nos níveis de complexos de I e II. Análise proteômica de mitocôndria dessas células também mostra alterações ligadas ao estresse oxidativo. Nossos dados em conjunto sugerem que cerulenina e orlistat induzem apoptose em células não tumorais como resultado de uma disfunção mitocondrial e de maneira independente de FASN

Abstract: We have previously reported that the fatty acid synthase (FASN) inhibitors, cerulenin or orlistat, induce apoptosis in B16-F10 mouse melanoma cells mediated by mitochondria. Here we investigate the effects of these inhibitors on the non-tumorigenic mouse cell line melan-a. Cerulenin or...

Abstract: We have previously reported that the fatty acid synthase (FASN) inhibitors, cerulenin or orlistat, induce apoptosis in B16-F10 mouse melanoma cells mediated by mitochondria. Here we investigate the effects of these inhibitors on the non-tumorigenic mouse cell line melan-a. Cerulenin or orlistat treatment decreased cells proliferation, accompanied by increased amounts of the tumor suppressor protein p21WAF1/Cip1, as well as induced apoptosis, but not necrosis, in melan-a cell line. Mitochondrial cytochrome c release and activation of caspases-9 and -3 were detected in melan-a-treated cells. siRNAi for FASN did not culminate in apoptosis, and FASN inhibitors treatment did not alter free fatty acids content in the non-tumorigenic cells, as verified by mass spectrometry, suggesting that cerulenin or orlistat induces apoptosis independent on FASN inhibition. Analysis of energy-linked functions of melan-a mitochondria showed inhibition of respiration followed by large stimulation of superoxide production. Respiratory inhibition after cerulenin or orlistat treatment, respectively, was restricted to the oxidation of NADH-linked substrates (39.9 or 60,8%) and succinate (45.8 or 51.8%) and was not significant when mitochondria were respiring on the complex IV substrate, N,N,N?,N?-tetramethyl-p-phenylendiamine. The protection conferred by the free radical scavenger NAC suggests that the mitochondrial dysfunction caused by these compounds is associated with oxidative stress and is mediated by the action of superoxide on the respiratory chain at the levels of complexes-I and II. Proteomic analysis of mitochondria melan-a cells also indicate major changes linked to oxidative stress. Taken together, the present results show that cerulenin or orlistat induces apoptosis in non-tumorigenic cells via mitochondrial dysfunction, independent on FASN inhibition