Orientador: Eduardo Rochete Ropelle

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas

Resumo: A proteína MKP-3 (MAPK phosphatase-3) possui capacidade de associar-se fisicamente e desfosforilar a FoxO1 no fígado, resultando em aumento da gliconeogênese e hiperglicemia na condição de obesidade e diabetes. Por outro lado, o exercício físico é uma das estratégias não farmacológicas mais...

Resumo: A proteína MKP-3 (MAPK phosphatase-3) possui capacidade de associar-se fisicamente e desfosforilar a FoxO1 no fígado, resultando em aumento da gliconeogênese e hiperglicemia na condição de obesidade e diabetes. Por outro lado, o exercício físico é uma das estratégias não farmacológicas mais utilizadas para a melhora do perfil glicêmico em pacientes diabéticos, no entanto, suas ações no tecido hepático são pouco conhecidas. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do treinamento físico sobre a expressão proteica da MKP-3, bem como sua interação com a FoxO1 em fígado de animais obesos. Ademais, tem como objetivo avaliar o mecanismo pelo qual o exercício físico é capaz de inibir a proteína MKP-3 em tecido hepático. Foram utilizados camundongos Swiss machos que receberam por 16 semanas uma dieta padrão ou rica em gordura. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos: controle (C), obeso sedentário (OB), obeso exercitado (EXE), obeso tratado com oligonucleotídeo antisense MKP-3 (OB-ASO), obeso tratado com sense MKP-3 (OB-sense) e obeso submetido ao treinamento físico e ao tratamento com antisense MKP-3 concomitantemente (OB-EXE-ASO). O protocolo de treinamento físico consistiu de natação com sessões de 60 minutos, 5 vezes por semana, com carga equivalente a 5% da massa corporal total do animal. O tratamento com antisense foi realizado através de injeções duas vezes ao dia, com um volume total de 2.0 ?l por dose (4.0 nmol/?l) por 5 dias. Ao final do experimento foram realizados os testes de tolerância ao piruvato (TTP) e teste de tolerância à insulina (TTI). Além disso, foram avaliados parâmetros fisiológicos (ingestão calórica, massa corporal, glicemia e insulinemia de jejum) e a análise molecular das proteínas (MKP-3, FoxO1, PGC1?, HNF-4?, PEPCK, G6Pase, ERK e CK2?) através das técnicas de imunoblot e imunoprecipitação. Utilizou-se a técnica de imunohistoquímica para análise da co-localização da MKP-3 no fígado dos animais. Os resultados obtidos demonstraram que o treinamento físico diminuiu expressão proteica de MKP-3 e a associação FoxO1/MKP-3 no fígado dos animais obesos. Além disso, camundongos obesos treinados apresentaram maiores níveis de FoxO1 fosforilada e diminuição da expressão das proteínas PGC-1? e HNF-4???no fígado se comparado aos animais obesos não submetidos ao treinamento físico. Verificam-se também menores níveis das enzimas gliconeogênicas PEPCK e G6Pase nos animais obesos treinados se comparado aos seus pares sedentários. Estes resultados a nível molecular foram acompanhados por alterações fisiológicas incluindo aumento da sensibilidade à insulina no fígado, menor produção hepática de glicose e redução da hiperglicemia nos camundongos obesos, independentemente da redução da massa corporal total. Ademais, não foram encontrados efeitos aditivos sobre os parâmetros fisiológicos e moleculares com o tratamento de oligonucleotídeo antisense MKP-3 e treinamento físico realizado concomitantemente nos animais obesos. Por fim, os efeitos supressivos do treinamento físico sobre a proteína MKP-3 parecem estar relacionados, no mínimo em parte, a diminuição na fosforilação das ERKs no fígado de camundongos obesos

Abstract: The protein MKP-3 (MAPK phosphatase-3) has the ability to physically associate with and dephosphorylate the FoxO1 in the liver, resulting in increased gluconeogenesis and hyperglycemia in the condition of obesity and diabetes. On the other hand, exercise is one of the most used...

Abstract: The protein MKP-3 (MAPK phosphatase-3) has the ability to physically associate with and dephosphorylate the FoxO1 in the liver, resulting in increased gluconeogenesis and hyperglycemia in the condition of obesity and diabetes. On the other hand, exercise is one of the most used non-pharmacological strategies for improving glycemic control in diabetic patients; however, their actions in liver tissue are poorly explored. The objective of this study was to investigate the effects of exercise on the expression of MKP-3 and its interaction with FoxO1 in the liver of obese animals. Furthermore, aimed at evaluating the mechanism by which physical exercise is able to inhibit protein MKP-3 in the liver. We used male Swiss mice that received a standard diet or high fat for 16 weeks. The animals were randomly divided into six groups: control (C), sedentary obese (OB), obese exercised (EXE), obese treated with MKP-3 antisense oligonucleotide (ASO-OB), obese treated with sense MKP-3 (OB- sense) and obese subjected to physical training and treatment with antisense MKP-3 concomitantly (OB-EXE-ASO). The protocol consisted of swimming exercise training with sessions of 60 minutes, five times per week with a load equivalent to 5% of the total body mass of the animal. Treatment with antisense was performed by injection twice daily, with a total volume of 2.0 ul per dose (4.0 nmol / microl) for 5 days. At the end of the experiment were performed to pyruvate tolerance tests (PTT) and insulin tolerance test (ITT). Furthermore, physiological parameters were evaluated (caloric intake, body weight, blood glucose and fasting insulin) and molecular analysis of proteins (MKP-3, FoxO1, PGC1a, HNF-4a PEPECK, G6Pase, ERK and CK2?) by immunoblotting and immunoprecipitation techniques. The immunohistochemistry technique was utilized to evaluate the co-localization of MKP-3 in the liver of the animals. The results showed that physical training decreased the protein expression of MKP-3 and association FoxO1/MKP-3. Further, trained obese mice had higher levels of phosphorylated FoxO1 and decreased PGC-1? and HNF-4??? There was also a decrease in the protein levels of PEPCK and G6Pase in the liver of mice exercised compared to sedentary obese mice. These results at molecular level were accompanied by physiological changes including increased insulin sensitivity in the liver, reduced hepatic glucose production and reduce hyperglycemia in obese mice, regardless of reducing total body mass. In addition, there were no additive effects of treatment with antisense oligonucleotide MKP-3 and physical training performed concurrently in obese animals. Finally, the suppressive effects of physical training on MKP-3 protein appear to be related at least in part, the decrease in phosphorylation of ERKs in the livers of obese mice