Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Os camundongos hipercolesterolêmicos (LDLr-/-) provenientes do Jackson Laboratory são modelos experimentais valiosos para o estudo da aterosclerose. Estes animais apresentam elevadas taxas de lipogênese, processo que consome grandes quantidades de NADPH. Pesquisas recentes revelaram que esta...

Resumo: Os camundongos hipercolesterolêmicos (LDLr-/-) provenientes do Jackson Laboratory são modelos experimentais valiosos para o estudo da aterosclerose. Estes animais apresentam elevadas taxas de lipogênese, processo que consome grandes quantidades de NADPH. Pesquisas recentes revelaram que esta linhagem possui, além da deleção do gene do receptor de LDL, uma mutação no gene da NADP- transidrogenase (NNT). A falta da NNT pode gerar estresse oxidativo devido ao fornecimento deficiente de NADPH mitocondrial. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação da elevação da lipogênese e da deficiência de NNT sobre o estado redox mitocondrial e suscetibilidade à transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Para tanto foram comparadas três linhagens de camundongos: LDLr-/- (deficiente do receptor de LDL e da NNT), C57BL6/J (deficiente apenas da NNT) e C57BL6/JUnib (controle). Foram avaliados: o controle respiratório mitocondrial (consumo de oxigênio), o estado redox de NAD(P) (fluorimetria), a susceptibilidade à transição de permeabilidade mitocondrial induzida por cálcio (inchamento e dissipação do potencial elétrico de membrana (??) sensíveis à ciclosprina A e a geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) (Amplex red®) em mitocôndrias isoladas de coração e fígado. Observamos que não houve diferenças significativas nos parâmetros respiratórios mitocondriais nos dois tecidos das três linhagens estudadas. Como esperado, as mitocôndrias dos camundongos LDLr-/- e C57BL6/J não podem sustentar o estado reduzido de NADPH in vitro, uma vez que são deficientes de NNT. Observamos que houve diferenças significativas entre as 3 linhagens quanto à TPM da seguinte maneira: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (controle) em mitocôndrias isoladas de fígado (inchamento e dissipação de ??) e em mitocôndrias de coração (??). Além disso, a produção de H2O2 por mitocôndrias hepáticas seguiu o mesmo padrão, sendo LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (controle). Em conjunto, estes resultados indicam que a maior suscetibilidade à TPM das mitocôndrias de camundongos LDLr-/- está correlacionada com diminuição de NADPH, tanto por aumento de consumo (devido a elevada lipogênese) quanto por diminuição de sua produção (deficiência em NNT)

Abstract: Hypercholesterolemic LDL receptor knockout mice (LDLr-/-) from Jackson Laboratory are valuable experimental models to study atherosclerosis development. These mice exhibit high rates of lipogenesis, a process that consumes large amounts of NADPH. It was recently discovered that the mice...

Abstract: Hypercholesterolemic LDL receptor knockout mice (LDLr-/-) from Jackson Laboratory are valuable experimental models to study atherosclerosis development. These mice exhibit high rates of lipogenesis, a process that consumes large amounts of NADPH. It was recently discovered that the mice strain used to produce the LDLr-/- also carries a homozygous NADP-transhydrogenase (NNT) mutation. Loss of NNT may cause oxidative stress due to a poor supply of mitochondrial NADPH. The objective of this study was to investigate the role of elevated lipogenesis and NNT deficiency on the mitochondrial redox status and susceptibility to mitochondrial permeability transition (MPT). Three mice strains were compared: LDLr-/- mice (deficient of both LDL receptor and NTT), C57BL6/J (deficient in NNT only) and the wild type control mice C57BL6/JUnib. We evaluated the mitochondrial respiratory control (oxygen consumption), the NAD(P) redox status (fluorimetry), the susceptibility to calcium induced mitochondrial permeability transition (swelling and dissipation of membrane potential (??) sensitive to cyclosporin A) and the generation of H2O2 (Amplex red®) in isolated heart and liver mitochondria. We observed no significant differences in mitochondrial respiratory parameters in both tissues of the three mice strains studied. As expected, the mitochondria of LDLr-/- and C57BL6/J mice cannot maintain the NADP in the reduced state in vitro, since they are deficient in NNT. Regarding the susceptibility to MPT, we observed significant differences among mitochondria from the 3 strains, as follows: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (control) in isolated liver mitochondria (swelling and potential dissipation) and in heart mitochondria potential dissipation). Furthermore, the production of H2O2 by the liver mitochondria followed the same MPT pattern: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (control). Together, these results indicated that the greater susceptibility of LDLr-/- mitochondria to MPT is correlated with decreased NADPH which is explained by both increased consumption (due to high lipogenesis) and decreased production (deficiency NNT)