Orientador: Margareth Castro Ozelo

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Os principais problemas relacionados ao tratamento de pacientes portadores de hemofilia A estão relacionados ao uso terapêutico de fator VIII (FVIII), sendo estes o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes anti-FVIII (inibidores), e o desenvolvimento de reações anafiláticas, que são...

Resumo: Os principais problemas relacionados ao tratamento de pacientes portadores de hemofilia A estão relacionados ao uso terapêutico de fator VIII (FVIII), sendo estes o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes anti-FVIII (inibidores), e o desenvolvimento de reações anafiláticas, que são eventos raros, no entanto potencialmente graves. As informações quanto aos isotipos de imunoglobulinas associados a estas duas situações clínicas ainda é limitado. O objetivo deste projeto foi avaliar as características da resposta imune humoral em pacientes com hemofilia A que apresentam inibidor e/ou em condição de reação alérgica ao FVIII. Para estas análises três metodologias foram aplicadas, (1) determinação de anticorpos inibitórios por método de Bethesda-Nijmegen, (2) determinação do isotipo de imunoglobulinas envolvidas subclasses da IgG, IgM e IgE anti-FVIII, por método de ELISA e (3) determinação de citocinas por método multiplex BDTM CBA® (cytometric bead array). Esse projeto foi dividido em três estudos. No primeiro estudo, foram analisadas amostras de 25 pacientes brasileiros com hemofilia A, sendo 44% destes afrodescendentes. Todos os pacientes receberam exclusivamente terapia de reposição com concentrado de FVIII derivado de plasma (pdFVIII) e produtos bypass após o desenvolvimento de inibidor. Cinco pacientes deste grupo foram acompanhados por uma análise longitudinal no período de até três anos. No segundo estudo, 4 pacientes com hemofilia A com inibidor foram avaliados no período em que foram tratados através do protocolo de indução de imunotolerância (ITI) para erradicação do inibidor, também em análise longitudinal. O terceiro consistiu da avaliação de incidência de reação alérgica em pacientes com hemofilia A. Três de 322 pacientes (0,9%) apresentaram reação alérgica após a exposição exclusivamente para pdFVIII durante os últimos quinze anos em nosso centro. Os resultados evidenciaram que a subclasse IgG4 é a principal na modulação em presença de anticorpos inibitórios, enquanto a IgG1 na maior parte das análises estava presente junto a baixos títulos de inibidor.Durante o tratamento de ITI os níveis das interleucinas anti-inflamatórias IL-4 e IL-6 acompanharam o decaimento dos títulos de inibidor e IgG4 nos pacientes que obtiveram sucesso ao tratamento. Além disso, no decorrer do protocolo observou-se uma resposta polarizada para o tipo Th1 como padrão de resposta na conquista da tolerância completa ao FVIII. No contexto da reação alérgica, apenas um dos três pacientes apresentou reatividade da IgE que foi exclusiva ao pdFVIII, sendo negativa no ensaio do IgE anti-rFVIII (anti-fator VIII recombinante), demonstrando que a reatividade não foi específica ao FVIII. O entendimento resposta imune humoral em pacientes com hemofilia A, incluindo a participação da IgG4 e IgG1 no mecanismos envolvendo a presença e erradicação dos inibidores e da IgE na reação alérgica, possibilita ampliar conceitos estabelecidos dos mecanismos envolvidos nessas duas situações. Isso poderá auxiliar no desenvolvimento de novos produtos menos imunogênicos e de novas estratégias para a indução de tolerância ao FVIII, que tenham maior eficiência e melhor custo benefício

Abstract: The main problems related to the treatment of hemophilia A patients are linked to the use of therapeutic factor VIII (FVIII). First, the development of neutralizing antibodies against FVIII (inhibitors), and second development of anaphylactic reactions, which are rare, however potencialy...

Abstract: The main problems related to the treatment of hemophilia A patients are linked to the use of therapeutic factor VIII (FVIII). First, the development of neutralizing antibodies against FVIII (inhibitors), and second development of anaphylactic reactions, which are rare, however potencialy severe. The knowledge about the immunoglobulin isotypes associated with these two clinical situations is still limited.The aim of this project was to evaluate the characteristics of the humoral immune response in patients with hemophilia A who have inhibitors and/or allergic reaction to FVIII. For these analyzes three methods were used (1) inhibitory anti-FVIII antibodies assay by Bethesda-Nijmegen (2) immunoglobulins isotype ELISA assay for anti-FVIII IgG subclasses, IgM and IgE and (3) cytokines assay by BDTM Cytometric bead array (BD CBA®) multiplex method. This project was divided in three studies. In the first study, we analyzed samples from 25 Brazilian hemophilia A patients with 44% African-descents. All patients received exclusively replacement therapy with plasma-derived (pdFVIII) concentrates, and bypassing agents after the development of inhibitors. Five patients from this group were followed for a longitudinal analysis in a period up to three years. In the second study, 4 hemophilia A patients with inhibitor were evaluated also in longitudinal analyses, during the induction of immunotolerance (ITI) treatment for the eradication of the inhibitor. The third study included the evaluation of the incidence of allergic reaction among hemophilia A patients. Three out of 322 patients (0.9%) had allergic reaction after exclusively exposure to pdFVIII during the last fifteen years in our center. The results of these studies demonstrated that IgG4 subclass is the main immunoglobulin involved in the modulation of the inhibitory antibodies, while IgG1 is associated with low-titer inhibitors. During the ITI protocol, the anti- inflammatory interleukins, IL-4 and IL-6 decreased following the IgG4 reduction among the patients that achieved success in the ITI treatment. In addition, during the ITI protocol it was observed a polarized Th1 immune response after the complete success achievement. In the context of allergic reaction, only one out of three patients presented IgE reactivity that was exclusively to pdFVIII, and the assay IgE anti-rFVIII (anti-recombinant FVIII) was negative, confirming that the reativity was not specific to FVIII. The understanding of the humoral immune response in hemophilia A patients, including the role of IgG4 and IgG1 in the mechanisms involving the presence and eradication of inhibitors, and the participation of IgE in allergic reaction, allows to better understand the established concepts of the mechanisms involved in these two situations. This may help the development of less immunogenic new products and new strategies for induction of tolerance to FVIII, with higher efficiency and best value