Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A produção de energia em células cancerosas é anormalmente dependente da glicólise aeróbica, resultando em aumento do consumo de glutamina para suprir os processos anabólicos. A hidrólise da glutamina é feita pelas glutaminases, as quais possuem três isoformas identificadas em mamíferos:...

Resumo: A produção de energia em células cancerosas é anormalmente dependente da glicólise aeróbica, resultando em aumento do consumo de glutamina para suprir os processos anabólicos. A hidrólise da glutamina é feita pelas glutaminases, as quais possuem três isoformas identificadas em mamíferos: Kidney-type glutaminase (KGA), Glutaminase C (GAC), e a Liver-type Glutaminase (LGA). Apesar das isoformas KGA e GAC serem idênticas em seu domínio catalítico, ambas apresentam distintas eficiências catalíticas para glutamina. Este projeto tem como objetivo encontrar a razão para esta diferença catalítica, estudando estruturalmente estas isoformas. A estrutura cristalográfica da GAC continha uma unidade assimétrica tetramérica, e como passo essencial para a acessibilidade do substrato glutamina essa tetramerização possivelmente estabiliza um "gating loop" em conformação aberta. Mutações sítio-dirigidas de resíduos do "gating loop" (L321RFNKL326) perturbaram a atividade da enzima, o que se correlacionou diretamente com a capacidade de oligomerização: mutantes que perderam atividade não foram capazes de formar oligômeros maiores que tetrâmero. Por imagens de microscopia eletrônica de transmissão, utilizando negative staining, vimos que a GAC forma estruturas filamentosas na presença de fosfato. Curiosamente, um mutante da região do gating loop, denominado GAC.K325A, apresentou uma eficiência catalítica alta e foi capaz de formar oligômeros extensos. Além disso, o mutante é insensível a fosfato e ao BPTES. O mutante GAC.R322A perdeu a atividade e não foi capaz de formar polímeros nem mesmo na presença de ativador fosfato. Portanto, a capacidade de oligomerizar das glutaminase justifica a atividade apresentada pela proteína: a GAC ¿ a glutaminase de maior atividade ¿ formou os maiores polímeros lineares, seguida pela KGA e, respectivamente, pela LGA (de baixa eficiência enzimática e insensível ao fosfato inorgânico). Além disso, mostramos que o mecanismo de inibição do BPTES é explicado pelo rompimento dos oligômeros. Apresentamos um mecanismo para a formação destes oligômeros, através da combinação de deleções, mutações pontuais, microscopia eletrônica, dinâmica e docking molecular. Nós simulamos a acetilação da Lis311 e sugerimos que esta modificação pós-traducional pode controlar níveis enzimáticos ao regular negativamente a formação de fibra. Por marcação com fluoróforo, determinamos constantes de dissociação aparentes para as espécies oligoméricas das isoformas GAC e KGA. Como a marcação interferiu na atividade enzimática, acreditamos que a técnica criou artefatos impróprios para percepção de interação diferencial entre superestruturas dessas isoformas. Células MDA-MB 231 com expressão endógena e knocked down de GAC foram utilizadas em ensaios celulares. Transfecções com GAC.K325A-V5 proliferaram mais, consumiram mais glutamina do meio de cultura e apresentaram maior turnover na medição de atividade de glutaminase. Coletivamente, estes indícios de que a formação de superestrutura de glutaminases in vivo propicia vantagens adaptativas às células tumorais mostram a importância da enzima como alvo terapêutico

Abstract: The energy production in cancer cells is abnormally dependent on aerobic glycolysis, resulting in increased consumption of glutamine to supply anabolic processes. The hydrolysis of glutamine is made by glutaminases, which have three isoforms identified in mammals: Kidney-type glutaminase...

Abstract: The energy production in cancer cells is abnormally dependent on aerobic glycolysis, resulting in increased consumption of glutamine to supply anabolic processes. The hydrolysis of glutamine is made by glutaminases, which have three isoforms identified in mammals: Kidney-type glutaminase (KGA), Glutaminase C (GAC) and the Liver-type Glutaminase (LGA). Although isoforms of KGA and GAC are identical in their catalytic domain, both have distinct catalytic efficiencies for glutamine. This project aims to find the reason for this difference catalytic, structurally studying these isoforms. The asymmetric unit of the crystallographic structure of GAC is composed by a tetramer, and this tetramerization is essential step for accessibility of the substrate glutamine, possibly stabilizing a "gating loop" in an open conformation. Site-directed mutations of residues from the "gating loop" (L321RFNKL326) disrupted the enzyme activity, which correlated directly with the ability of oligomerization: mutant which had lost activity were unable to form higher oligomers than tetramer. By transmission electron microscopy images using negative staining, we saw that the GAC forms filamentous structures in the presence of phosphate. Interestingly, a mutant in the region of the gating loop, called GAC.K325A, showed a very high catalytic efficiency and was able to form large oligomers. Furthermore, this mutant is insensitive to phosphate and BPTES. The mutant GAC.R322A lost activity and was unable to form polymers even in the presence of phosphate activator. Therefore, the oligomerization ability justifies the glutaminase activity exhibited by the protein: GAC - the higher glutaminase activity - formed the largest linear polymers, followed by KGA and, respectively, by LGA (low enzymatic efficiency and insensitive to inorganic phosphate). Furthermore, we showed the mechanism of BPTES inhibition is explained by disruption of oligomers. We present a mechanism for the formation of these oligomers, through a combination of deletions, point mutations, electron microscopy, molecular dynamics and docking. We simulated the acetylation of Lys311, and we found that this post-translational modification can maybe control enzymatic levels by down regulate the fiber formation. Using fluorescent labeling, we were able to define apparent dissociation constants of GAC and KGA isoforms. As the label interfered in the enzymatic activity, we believe that the technique produced artifacts unsuitable for the perception of differential interaction between isoform¿s superstructures. MDA-MB 231 cells with endogenous expression and knocked down GAC were used in cellular assays. Transfections with GAC.K325A-V5 proliferated more, consumed more glutamine from the culture medium and had higher turnover in glutaminase activity measurements. Collectively, these are evidence that the formation of superstructure glutaminases in vivo provides adaptive advantages to tumor cells and shows the importance of the enzyme as a therapeutic target