Orientadores: Sônia Maria Alves Bueno, Síndélia Freitas Azzoni

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: Emergindo como alvo de estudos para fins terapêuticos, acompanhado de novas tecnologias a fim de explorar todo seu potencial e especificidade, o DNA plasmidial (pDNA) tem demonstrando um importante papel na nova geração de vacinas e terapia gênica como um vetor não viral. No entanto, há...

Resumo: Emergindo como alvo de estudos para fins terapêuticos, acompanhado de novas tecnologias a fim de explorar todo seu potencial e especificidade, o DNA plasmidial (pDNA) tem demonstrando um importante papel na nova geração de vacinas e terapia gênica como um vetor não viral. No entanto, há grandes desafios para atender altas demandas de preparações de vetores plasmidiais (pDNA), seguindo rigorosos padrões das agências reguladoras internacionais. As dificuldades sobretudo, são encontradas no downstream processing, com alto custo e operações não apropriadas para uso em larga escala e nos longos e caros kits comerciais, este último utilizado para ensaios pré-clínicos. Almejando, explorar as características do DNA plasmidial e tornar cada vez mais factível sua produção e purificação, esta pesquisa teve como foco o desenvolvimento de um protocolo para obtenção de pDNA para aplicação em ensaios in vitro com possível escalonamento para larga escala. Para tanto, buscou-se adsorventes seletivos para a etapa de pré-purificação de pDNA diretamente do lisado celular. O trabalho foi baseado em géis de agarose (S) com ligantes de natureza hidrofóbica e tiofílica, visando testar o comportamento do pDNA em cromatografia negativa e cromatografia tiofílica aromática. Os ligantes eleitos para investigação foram os aminoácidos de natureza hidrofóbica, fenilalanina (Phe) e D-triptofano (T), ambos imobilizados covalentemente em Sepharose 6B®, e um tiofílico, a mercaptopiridina. O tampão de adsorção, e os sais adicionados, foram escolhidos com o objetivo de favorecer um ambiente hidrofóbico, de tal forma que a interação das biomoléculas presentes no lisado celular com os ligantes fosse favorecida. Os sais utilizados para tal foram citrato de sódio 1,5 mol/L, fosfato de potássio 2,0 mol/L e sulfato de amônio 1,5 mol/L. Os resultados obtidos com os sistemas fenilalanina-agarose e D-triptofano-agarose demonstraram seu potencial na retenção de moléculas de RNA e na remoção de grande parte de endotoxinas e proteínas. O sistema adsortivo mercaptopiridina-agarose, permitiu uma urificação bastante satisfatória, com remoção total de endotoxinas e relevante recuperação de pDNA.

Abstract: Coming up as a target for therapeutic studies, together with new technologies in order to explore its potential use and specificity, plasmid DNA (pDNA) has demonstrated an important role in new generation of vaccines and gene therapy as a non-viral vector. However, there are huge...

Abstract: Coming up as a target for therapeutic studies, together with new technologies in order to explore its potential use and specificity, plasmid DNA (pDNA) has demonstrated an important role in new generation of vaccines and gene therapy as a non-viral vector. However, there are huge challenges to meet high demands of plasmid vectors (pDNA) preparation, following strict standards of international regulatory agencies. Its difficulties are found in downstream processing, with high cost operations which are not suitable for large-scale use and in the long expensive commercial kits, the last one used for preclinical trials. Aiming then, to explore DNA plasmid characteristics and making its production and purification even more feasible, this research focused on a development of a protocol to obtain pDNA for assays in vitro applications with a possible staggering to large scale. Therefore selective adsorvents were sought for pre-step purification of pDNA directly from cell lysate. The work was based on agarose gels (S) with ligands of hydrophobic and thiophilic nature aiming to test pDNA actions in negative chromatography and thiophilic aromatic chromatography. The ligands chosen for investigation were the amino acids of hydrophobic nature, phenylalanine (Phe) and D-tryptophan (T), both covalently immobilized on Sepharose 6B ®, and a thiophilic one, mercaptopyridine. The adsorption caps and as well as its concentration, experienced in this work were chosen in order to support a hydrophobic environment, so that the interaction of the biomolecules in the lysate cell would be easier with the ligands. The salts used for this interaction were sodium citrate 1.5 mol/L, potassium phosphate 2.0 mol/L and ammonium sulfate 1.5 mol/L. The results achieved with the systems phenylalanine- agarose and D-tryptophan-agarose have demonstrated its potential in the retention of the RNA molecules and the removal of most part of endotoxin, and proteins. The mercaptopyridine-agarose adsorptive system enabled a satisfactory purification, with a total removal of endotoxins and pDNA relevant recovery.