Orientadores: Nadja Cristhina de Souza Pinto, Anibal Eugenio Vercesi

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Xeroderma Pigmentosum (XP) é uma doença rara, autossômica recessiva, caracterizada por fotossensibilidade, mudanças pigmentares, envelhecimento precoce da pele e incidência elevada de neoplasias de pele. XP é causada por mutações em, pelo menos oito genes, que caracterizam sete diferentes...

Resumo: Xeroderma Pigmentosum (XP) é uma doença rara, autossômica recessiva, caracterizada por fotossensibilidade, mudanças pigmentares, envelhecimento precoce da pele e incidência elevada de neoplasias de pele. XP é causada por mutações em, pelo menos oito genes, que caracterizam sete diferentes grupos de complementação genética (XP-A a XP-G) e um tipo variante (XP-V). Mutações em cada em dos genes envolvidos resultam em diferentes graus de severidade da doença, principalmente quanto ao comprometimento neurológico. Pacientes XP-C apresentam mutações no gene Xpc, que resultam, geralmente, em proteínas truncadas e instáveis. XPC é uma proteína envolvida na via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e sua função é reconhecer a lesão na fita de DNA e dar início ao reparo. Recentemente, a participação indireta de XPC no reparo por excisão de bases (BER) foi sugerida, através de sua interação física e funcional com a DNA glicosilase OGG1. Uma vez que OGG1 é essencial para a remoção de purinas oxidadas do DNA mitocondrial, nós hipotetizamos que o DNAmt, e consequentemente a função mitocondrial, estariam comprometidas em células deficientes em XPC. Desta forma, este trabalho se propôs a investigar alterações bioenergéticas mitocondrias em células obtidas de pacientes XP-C. Nossos resultados revelaram que linhagens celulares XP-C apresentavam menor função mitocondrial, apesar de não apresentarem alterações no número de cópias de DNAmt. O consumo de oxigênio pelo complexo I estava significativamente diminuído em células XP-C quando comparado à células controle, enquanto que o consumo de O2 via os complexos II, III e IV foi maior em células XP-C. A capacidade de captar cálcio também se mostrou alterada nas células XP-C, uma vez que essa célula era incapaz de captar e reter concentrações fisiológicas desse íon. A produção de espécies reativas de oxigênio foi significativamente maior em células XP-C comparadas a células controle. Em acordo, a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e glutationa peroxidase foi menor em células XP-C, indicando um desbalanço redox nessas células. A análise da expressão de genes relacionados à biogênese mitocondrial revelou que um regulador transcricional fundamental, o coativador PGC1?, estava significativamente reduzido em células XP-C transformadas e primárias. Resultados de Western blotting e imunofluorescência revelaram que as alterações bioenergéticas e genômicas observadas em células XP-C eram via sinalização e não por efeito direto, uma vez que nas condições experimentais utilizadas neste trabalho, XPC não está presente na mitocôndria. Nossos resultados demonstram, pela primeira vez, que a proteína XPC exerce um papel indireto na manutenção da integridade funcional da mitocôndria, provavelmente através de seu papel no controle da expressão de genes envolvidos na biogênese mitocondrial

Abstract: Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare autosomal recessive disorder characterized by photosensitivity, pigmentary changes, premature skin aging and increased incidence of skin cancer. XP is caused by mutations in at least eight genes, which characterize seven different genetic...

Abstract: Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare autosomal recessive disorder characterized by photosensitivity, pigmentary changes, premature skin aging and increased incidence of skin cancer. XP is caused by mutations in at least eight genes, which characterize seven different genetic complementation groups (XP-A to XP-G) and variant type (XP-V). Mutations in each gene result in varying degrees of severity, mostly regarding the presence or not of neurodegeneration. XP-C is caused by mutations in the Xpc gene, resulting, mostly, in a truncated and unstable protein. The XPC protein is involved in the nucleotide excision repair pathway (NER), where it functions as a damage recognition factor. Recently, a role for XPC in the base excision repair (BER) pathway has been proposed, through its physical and fucntional interaction with the DNA glycosylase OGG1. Since OGG1 has a major function in repairing oxidized purines in the mitochondrial DNA (mtDNA), we hypothesized that XPC played a role in maitaining mtDNA integrity, and consequently, mitochondrial function. Thus, this study proposes to investigate mitocondrial function in XP-C cell. Our results showed that XP-C cells had less mitochondrial function, although without changes in mtDNA copy number. Oxygen consumption through complex I was lower in XP-C cells compared to control cells, while respiration through complexes II, III and IV was higher in XP-C cells. Calcium uptake and retention by mitochondria was also decreased in XP-C cells, as these cells were unable to retain even physiological spikes in calcium concentration. Reactive oxygen species production was significantly higher in XPC cells compared to controls. In agreement to that, the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase and glutathione peroxidase was significatly decreased in XP-C cells, indicating that these cells are under a severe redox signaling inbalance. The analysis of the expression of genes related to mitochondrial biogenesis revealed that the key transcriptional regulator PGC1? was significantly lower in both transformed and primary XP-C cells. The results of Western blotting and imunofluorescence revealed that the bioenergetic impairment observed in XP-C cells is likely the result of changes in expression and signaling pathwyas, since, under the experimental conditions used here, XPC is not present in mitochondria. Our results indicate, for the first time, that XPC plays an important role in mitochondrial maintenace, likely via its role in transcription regulation of mitochondrial biogenesis