Orientador: Sonia Maria Alves Bueno

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: A produção de proteínas recombinantes em plantas transgênicas tem se mostrado uma forma segura, eficiente e barata de obtenção em grande escala de várias proteínas de interesse, tais como vacinas, enzimas industriais, bioativos, biofarmacos e anticorpos e seus fragmentos. Contudo, para que a...

Resumo: A produção de proteínas recombinantes em plantas transgênicas tem se mostrado uma forma segura, eficiente e barata de obtenção em grande escala de várias proteínas de interesse, tais como vacinas, enzimas industriais, bioativos, biofarmacos e anticorpos e seus fragmentos. Contudo, para que a produção de proteínas recombinantes em plantas se torne viável é necessário o desenvolvimento de um processo de recuperação e separação da molécula alvo que seja eficiente e reprodutivo, pois a produção de biomoléculas em plantas transgênicas, assim como os métodos tradicionais de produção, apresentam componentes indesejáveis que devem ser removidos. Neste trabalho, avaliou-se a purificação de fragmentos Fab de IgG humana adicionados artificialmente (spiking) a extrato protéico de soja não transgênica utilizando-se a técnica de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Estudou-se o efeito dos quelatos IDA-Ni(II) e TREN-Ni(II), dos sistemas tamponantes Tris-HCl, fosfato de sódio e Mes, na presença e na ausência de sal (NaCl) na purificação de fragmentos Fab. Primeiramente foram realizados experimentos cromatográficos com as proteínas nativas do extrato proteico do grão de soja. Dos resultados obtidos, selecionou-se, para o adsorvente agarose-TREN-Ni(II), o sistema tamponante Tris-HCl/Tris-HCl na ausência de NaCl, e para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), selecionou-se o sistema tamponante fosfato de sódio/acetato de sódio contendo NaCl. Estes sistemas tamponantes e adsorventes foram utilizados para purificação dos fragmentos Fab adicionados (spiking) ao extrato proteico de grãos de soja. Em agarose-TREN-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia negativa, obtendo-se 66% dos fragmentos Fab na etapa de flowthrough e lavagem, com um grau de pureza de 91% e fator de purificação de 1,4. Para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia tradicional (eluição a pH 5,8), obtendo-se alto grau de pureza do fragmento Fab purificados, com um fator de purificação de 2,5. Este estudo contribuiu para obter conhecimento de base para posterior aplicação da técnica de IMAC na purificação de proteínas recombinantes produzidas em sementes de plantas transgênicas

Abstract: The recombinant proteins production using transgenic plants have been considered a safe, efficient and cheap way of producing on large scale innumerous proteins of interest, such as vaccines, industrial enzymes, bioactives, biopharmaceuticals and antibody and it fragments. However, for the...

Abstract: The recombinant proteins production using transgenic plants have been considered a safe, efficient and cheap way of producing on large scale innumerous proteins of interest, such as vaccines, industrial enzymes, bioactives, biopharmaceuticals and antibody and it fragments. However, for the production of recombinant proteins in plants become viable is necessary to develop a process for recovery and separation of the target molecule that is efficient and reproductive, because the production of biomolecules in transgenic plants, as well as traditional production methods, have components reactions which must be removed. In this work, the purification of Fab fragments of human IgG added artificially (spiking) to extract non-transgenic soy protein, using the technique of affinity chromatography on immobilized metal ions (IMAC), was evaluated. The effect of chelating agents IDA-Ni(II) and TREN-Ni(II), and the buffers Tris, sodium phosphate and Mes, in presence and the absent of NaCl, was studied for the Fab purification. First, the chromatographic experiments with the native proteins of soybean extract were performed. From the results obtained, it was selected, for the adsorbent TREN-Ni(II), the buffers system Tris-HCl/Tris-HCl without NaCl, and for the adsorbent IDA-Ni(II), the buffer system sodium phosphate/ sodium acetate with NaCl was selected. These adsorbents and buffer systems were used for purification of Fab fragments added (spiking) to soybean extract proteins. In the agarose adsorbent TREN-Ni (II), Fab fragments were purified by negative chromatography, obtaining 66% of Fab fragments in flowthrough and wash steps with a purity of 91% and purification factor of 1.4. For the adsorbent agarose-IDA-Ni (II), Fab fragments were purified by traditional chromatography (elution at pH 5.8), obtaining a high purity of the purified FAB, with a purification factor of 2.5. This study contributed to obtain knowledge base for application of the technique on the IMAC purification of recombinant proteins produced in transgenic plant seeds