Orientador: Luciana Bolsoni Lourenço Morandini

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Dentre as espécies do gênero Engystomops, somente as três espécies do clado Edentulus (E. freibergi, E. petersi e E. pustulosus) e duas das seis espécies do clado Duovox (E. pustulatus e E. puyango) tinham o número diploide descrito, e a localização cariotípica das NORs (regiões...

Resumo: Dentre as espécies do gênero Engystomops, somente as três espécies do clado Edentulus (E. freibergi, E. petersi e E. pustulosus) e duas das seis espécies do clado Duovox (E. pustulatus e E. puyango) tinham o número diploide descrito, e a localização cariotípica das NORs (regiões organizadores de nucléolo) e das regiões heterocromáticas era conhecida apenas para E. freibergi, E. petersi e E. puyango. Os dados disponíveis mostravam que as espécies do clado Duovox já cariotipadas apresentavam 2n=20, enquanto o número cromossômico diploide de todas as espécies do clado Edentulus era 2n=22, assim como o das espécies de Physalaemus e Edalorhina, gêneros mais proximamente relacionados a Engystomops. Dessa forma, uma redução do número diploide de 2n=22 para 2n=20 era considerada na história de Engystomops, mas não era possível inferir se essa era uma sinapomorfia de E. puyango e E. pustulatus ou de todo o clado Duovox. Em relação ao clado Edentulus, algumas dúvidas também persistiam. Recentes estudos propunham a presença de um complexo de espécies amazônicas sendo confundidas com E. petersi. Citogeneticamente puderam ser reconhecidos três grupos nesse complexo, que corresponderam a populações de Puyo (Equador), Yasuní (Equador) e La Selva (Equador), diferentes ainda daquele de E. freibergi (Brasil). Nem sempre é possível a identificação de homeologias cromossômicas entre esses grupos, o que dificulta o reconhecimento dos possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos na divergência cariotípica no gênero em questão. Também permanecia pouco explorada a diferenciação entre os cromossomos sexuais heteromórficos reconhecidos em populações de E. petersi e em E. freibergi. Os objetivos do presente trabalho foram estudar citogeneticamente as espécies de Engystomops do clado Duovox, melhor caracterizar os cromossomos sexuais de E. freibergi por meio de pintura cromossômica e buscar novos marcadores citogenéticos para auxiliar na identificação de homeologias cromossômicas nesse gênero. A análise cariotípica mostrou que as espécies E. randi, E. guayaco, E. montubio, E. pustulatus e E. coloradorum apresentaram 2n=20, assim como as espécies E. puyango e E. pustulatus, previamente cariotipadas, corroborando a hipótese de essa característica provavelmente seja uma sinapomorfia do grupo Duovox. Em E. coloradorum, foi encontrada uma fêmea triploide, que consistiu no primeiro relato de poliploidia para Engystomops. Em todas e somente nas fêmeas dessa espécie foi encontrado um heteromorfismo referente à presença de NOR dentre os cromossomos 10 homólogos o que sugere que esses sejam cromossomos sexuais e que o sistema de determinação do sexo em E. coloradorum seja ZZ/ZW. Quanto à análise dos cromossomos sexuais de E. freibergi, foi possível isolar por microdissecção os cromossomos X e Y e produzir sondas a partir da amplificação de segmentos desses cromossomos. A utilização da técnica de pintura cromossômica com tais sondas permitiu inferir que as regiões proximais do cromossomo X e do cromossomo Y de E. freibergi apresentam similaridade molecular, o que sugere a possibilidade de se tratarem de regiões pseudo-autossômicas. As sondas dos cromossomos sexuais de E. freibergi não detectaram os cromossomos X e Y de E. petersi de Puyo nem os cromossomos do par 11 homomórfico de E. petersi de Yasuní, não evidenciando, portanto, grande similaridade entre eles. O isolamento, a caracterização e a localização cariotípica do DNAr 5S das espécies pertencentes ao grupo Duovox permitiram inferir a possível homeologia do par cromossômico 6 dessas espécies entre si e com o par 6 das espécies do grupo Edentulus. Ainda, o uso de sondas PcP190EcoRI, referentes a uma família de DNA repetitivo derivada de DNAr 5S, permitiu identificar os cromossomos 5 de E. randi, E. guayaco e E. coloradorum e diferenciá-los dos cromossomos 6 dessas espécies, portadores do sítio de DNAr 5S do tipo II. Além disso, essa mesma sonda identificou a região pericentromérica do braço curto do cromossomo 3 (e do cromossomo 5 de E. petersi de Yasuní) de todas as espécies do gênero, com excessão de E. coloradorum, sugerindo outra possível homeologia entre esses cromossomos. Dessa forma, com o emprego de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares foi possível fornecer importante contribuição para o estudo da evolução do gênero Engystomops

Abstract: Of the species in the genus Engystomops, only three species of the Edentulus clade (E. freibergi, E. petersi and E. pustulosus) and two species of the Duovox clade (E. pustulatus and E. puyango) have had their diploid number described, while the NOR (nucleolus organizer region) and the...

Abstract: Of the species in the genus Engystomops, only three species of the Edentulus clade (E. freibergi, E. petersi and E. pustulosus) and two species of the Duovox clade (E. pustulatus and E. puyango) have had their diploid number described, while the NOR (nucleolus organizer region) and the heterochromatic sites were known only for E. freibergi, E. petersi and E. puyango karyotypes. The species of Duovox clade had 2n=20, while the diploid chromosome number of all species of Edentulus clade was 2n=22, which is the same diploid number of species of Physalaemus and Edalohina, genera closely related to Engystomops. Thus, the diploid number reduction from 2n=22 to 2n=20 was supposed, but it was not possible to infer if this was a synapomorphy of E. puyango and E. pustulatus or a synapomorphy of the entire Duovox clade. With regards to the Edentulus clade, some doubts also persisted. Recent studies proposed a complex of Amazonian species misidentified as E. petersi and it was possible to cytogenetically recognize three groups in this complex that corresponded to populations from Puyo (Ecuador), Yasuní (Ecuador) and La Selva (Ecuador). All of these karyotypes also differed from the E. freibergi (Brazil) karyotype. Chromosome homologies are not easily recognized between these groups, a fact that makes difficult the identification of chromosome rearrangements involved in karyotypic divergence in this genus. Additionally, the differentiation of the heteromorphic sex chromosomes found in the E. petersi and E. freibergi karyotypes remained unexplored. The goals of the present work are (1) to cytogenetically study the species of Duovox clade, (2) to better characterize the sex chromosomes of E. freibergi by means of chromosome painting and (3) to find new cytogenetic markers to identify potential chromosome homologies in this genus. The karyotypic analysis showed that the species E. randi, E. guayaco, E. montubio, E. pustulatus and E. coloradorum had 2n=20, as previously described in E. pustulatus and E. puyango. This corroborates the hypothesis that the diploid number 2n=20 is likely a synapomorphy of the Duovox clade. Among the specimens of E. coloradorum, a triploid female was found, which is the first report of polyploidy for the genus Engystomops. In all the females of this species, there was a NOR heteromorphism in the homologous chromosomes 10, suggesting that these may be ZZ/ZW sex chromosomes. Regarding the sex chromosomes of E. freibergi, it was possible to isolate the X and Y chromosomes by microdissection and to produce probes by amplifying segments of the microdissected chromosomes. The hybridization of these probes in E. freibergi metaphases showed that the proximal regions of the X and Y chromosomes of this species had molecular similarity, thus suggesting that they may be pseudoautosomal regions. The sex chromosome probes from E. freibergi detected neither the X nor the Y chromosome of E. petersi from Puyo nor the chromosomes of homomorphic pair 11 of E. petersi from Yasuní. This implies no significant similarity between them and the E. freibergi sex chromosomes. The isolation, characterization and karyotypic localization of the rDNA 5S from the species of the Duovox clade made it possible to infer the homeology of chromosome pair 6 of those species, as well as their homeology with chromosome pair 6 of the species of the Edentulus clade. Further, the probes PcP190EcoRI, which are related to a family of satellite DNA derived from rDNA 5S, made it possible to identify chromosome 5 of E. randi, E. guayaco and E. coloradorum and to differentiate them from chromosome 6, which carry type II rDNA 5S. In conclusion, both classical and molecular cytogenetic techniques provided important contributions for the study of the evolution of the genus Engystomops