Orientador: Wander José da Silva

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: O fluconazol (FLZ) é um antifúngico amplamente utilizado no tratamento da candidose associada ao uso de prótese dental. No entanto, o sucesso desta terapia pode ser dificultado pela presença da matriz extracelular dos biofilmes de Candida albicans. Estudos já foram conduzidos avaliando o...

Resumo: O fluconazol (FLZ) é um antifúngico amplamente utilizado no tratamento da candidose associada ao uso de prótese dental. No entanto, o sucesso desta terapia pode ser dificultado pela presença da matriz extracelular dos biofilmes de Candida albicans. Estudos já foram conduzidos avaliando o efeito do FLZ em biofilmes de C. albicans, no entanto, estudos que simulem uma condição na qual os biofilmes são desenvolvidos na presença do FLZ são escassos. Ainda, na tentativa de avaliar a organização tridimensional destes biofilmes, várias técnicas de microscopia já foram descritas, apesar de pouca atenção ser dada na análise da matriz extracelular. Frente ao exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a matriz extracelular de biofilmes de C. albicans na presença de concentração salivar de FLZ. Dois estudos foram conduzidos e, em ambos, discos (10 mm x 2 mm) de resina acrílica à base de poli (metil metacrilato) foram confeccionados e cobertos com uma película de saliva sobre a qual biofilmes de C. albicans foram desenvolvidos. O primeiro estudo foi conduzido com o objetivo de definir uma metodologia para análise da matriz extracelular. Biofilmes de C. albicans ATCC 90028 foram desenvolvidos em meio de cultura sem suplementação (controle) ou suplementado com glicose ou sacarose, por 72 horas. Durante o desenvolvimento dos biofilmes foi adicionado o corante Concanavalina A (ConA) para a marcação da matriz extracelular. Após o desenvolvimento, os biofilmes foram corados com SYTO 9 para a marcação das células. As imagens obtidas por microscopia confocal foram analisadas pelo software COMSTAT. Para confirmação dos resultados, os biofilmes foram coletados e analisados bioquimicamente para determinação da composição da matriz de polissacarídeos pelo método fenol-sulfúrico. Os dados foram analisados por ANOVA seguido do teste de Tukey com nível de significância de 5%. Para o segundo estudo, biofilmes de C. albicans (ATCC 90028) e de dois isolados clínicos (P01 e P34) foram desenvolvidos em meio de cultura contendo FLZ na concentração biodisponível na saliva (2,56 ?g/mL), durante 48h. O grupo controle foi desenvolvido sem a presença de fluconazol. O número de células viáveis foi quantificado por diluição seriada, e a matriz extracelular analisada bioquimicamente, além da avaliação por microscopia confocal. Os dados foram analisados pelo teste t de Student com nível de significância de 5%. No primeiro estudo, observou-se que o uso de ConA permitiu uma marcação eficaz da matriz extracelular, confirmada pela análise bioquímica (p < 0,05). No segundo estudo, houve uma redução de 80% no número de células viáveis dos biofilmes desenvolvidos na presença de FLZ (p < 0,001). Considerando-se a proporção de polissacarídeos produzidos pelo número de células viáveis, observou-se que nos grupos experimentais, C. albicans foi capaz de produzir mais matriz extracelular do que os grupos controle (p < 0,05). Este resultado foi confirmado pelas imagens obtidas por microscopia confocal. Conclui-se que a microscopia confocal é uma ferramenta efetiva na análise da matriz extracelular de biofilmes de C. albicans, e que os biofilmes de C. albicans desenvolvidos na presença de FLZ apresentaram maior produção de matriz extracelular

Abstract: Fluconazole (FLZ) is a commonly used antifungal agent to treat patients with Candida-associated denture stomatitis. However, the success of this therapy may be compromised by the presence of extracellular matrix of C. albicans biofilms. Although studies have been conducting evaluating the...

Abstract: Fluconazole (FLZ) is a commonly used antifungal agent to treat patients with Candida-associated denture stomatitis. However, the success of this therapy may be compromised by the presence of extracellular matrix of C. albicans biofilms. Although studies have been conducting evaluating the effect of FLZ on C. albicans biofilms, studies that simulate the condition in which biofilms were allowed to grow in the presence of FLZ are limited. Additionally, in order to evaluate the three-dimensional organization of these biofilms, several microscopic techniques have been described, although little attempt has been paid to assess the extracellular matrix. The objective of this study was to investigate the extracellular matrix of C. albicans biofilms in the presence of salivary concentration of FLZ. For this, two studies were conducted. For both studies, discs (10 mm x 2 mm) were fabricated using poly (methyl methacrylate). Salivary pellicle was formed on disc surface and C. albicans biofilms were developed. In the first study a methodology for analyzing the extracellular matrix was defined. C. albicans ATCC 90028 biofilms were developed in culture media without (control) or with supplementation by glucose or sucrose for 72 hours. During development, biofilms were stained with Concanavalin A (ConA) in order to label the extracellular matrix. After, cells were also labeled with SYTO-9. Images obtained by confocal microscopy were analyzed by COMSTAT software. In order to confirm the results, biofilms were subjected by the biochemical phenol-sulfuric method. Data were analyzed by ANOVA followed by Tukey's test at a significance level set at 5%. For the second study, biofilms of an ATCC 90028 and two clinical isolates (, P01 and P34) were developed for 48 hours. FLZ at 2.56 ?g/mL, concentration bioavailable in saliva, was added to culture media of experimental groups. Biofilms were investigated for the number of viable cells by serial dilution and extracellular matrix production was analyzed by phenol-sulfuric method and confocal microscopy. Data were analyzed by Student's t-test, with significance level set at 5%. In the first study, the use of ConA provided an effective labeling of extracellular matrix, which was confirmed by phenol-sulfuric method (p < 0.05). In the second study, a reduction of 80% was observed in the number of viable cells for C. albicans biofilms developed in the presence of FLZ (p < 0.001). Considering the proportion of polysaccharides produced by the number of viable cells, it was observed that in the experimental groups, C. albicans was able to produce more extracellular matrix than the control groups (p < 0.05). This result was confirmed by confocal images. It was concluded that confocal microscopy is an effective tool to investigate the extracellular matrix of C. albicans biofilms; and C. albicans biofilms developed in the presence of FLZ present increased extracellular matrix production