Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A lesão do nervo periférico em animais neonatos resulta em extensa morte neuronal na medula espinal e nos gânglios das raízes dorsais. Como a maior parte da perda neuronal é devido ao estresse oxidativo e mecanismos apoptóticos, vários estudos têm sido realizados a fim de investigar o efeito...

Resumo: A lesão do nervo periférico em animais neonatos resulta em extensa morte neuronal na medula espinal e nos gânglios das raízes dorsais. Como a maior parte da perda neuronal é devido ao estresse oxidativo e mecanismos apoptóticos, vários estudos têm sido realizados a fim de investigar o efeito de substâncias neuroprotetoras. Dentre esses fármacos, o antioxidante Tempol tem mostrado resultados promissores, uma vez que é capaz de quelar espécies reativas de oxigênio (ROS) e minimizar, ou mesmo prevenir, danos teciduais. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos neuroprotetores do Tempol sobre a morte neuronal induzida pela secção do nervo isquiático em ratos recém-nascidos. Para as análises morfológicas, ratos Wistar com dois dias de idade (P2), foram submetidos à secção do nervo isquiático esquerdo e foram divididos em dois grupos: (1) grupo tratado com Tempol (24mg/kg), 10 minutos, 6 horas e a cada 24 horas após a lesão por até 1 semana; (2) grupo veículo - tratado com o veículo de diluição do Tempol nos mesmos períodos de tratamento. Os animais de ambos os grupos foram sacrificados em tempos de sobrevida de 8, 12, 24, 72 horas e uma semana após a lesão. O lado contralateral da medula foi utilizado como controle interno para análise dos resultados. Após os respectivos dias de sobrevida, os animais foram anestesiados e submetidos à toracotomia para perfusão com solução salina e fixadora. Em seguida, o conjunto contendo a intumescência lombar e as raízes nervosas foram processadas para posterior confecção dos cortes histológicos. Secções transversais de 12 ?m da intumescência lombar foram utilizadas nas técnicas de Microscopia de luz para avaliação da sobrevivência neuronal e TUNEL para detecção e quantificação de células apoptóticas. Os resultados demonstraram que o tratamento com Tempol aumentou a sobrevivência de motoneurônios da medula espinal em 15% após 8 horas; 19% após 12 horas; 13% após 24 horas; 15% após 72 horas e 21% após uma semana pós-lesão (p<0,0001). Da mesma forma, os animais tratados com Tempol apresentaram uma diminuição do número de células TUNEL positivas, indicando uma redução dos eventos apoptóticos. Para a realização da qRT-PCR, a intumescência lombar foi dissecada 12 e 24 após lesão. Os resultados mostraram um aumento na expressão gênica de 13, 3 e 28 vezes para bax, caspase3 e bcl2, respectivamente, após 12 horas da axotomia e tratamento com Tempol. Após 24 horas houve redução na expressão dos genes estudados, porém, esta não foi estatisticamente significativa. Como um todo, os presentes resultados mostraram que o tratamento com Tempol é neuroprotetor, levando à maior sobrevivência de motoneurônios após a lesão de nervo periférico, minimizando a ocorrência de eventos apoptóticos

Abstract: The peripheral nerve injury in newborn animals results in extensive neuronal death in the spinal cord and dorsal root ganglia. Since most neuronal loss is due to oxidative stress and apoptotic mechanisms, several studies have been conducted to investigate the effect of neuroprotective...

Abstract: The peripheral nerve injury in newborn animals results in extensive neuronal death in the spinal cord and dorsal root ganglia. Since most neuronal loss is due to oxidative stress and apoptotic mechanisms, several studies have been conducted to investigate the effect of neuroprotective substances. Among these drugs, the antioxidant Tempol has shown promising results as it is capable of chelating reactive oxygen species (ROS) and to minimize or even prevent, tissue damage. In this sense, the present study aimed to evaluate the neuroprotective effects of Tempol on neuronal death induced by sciatic nerve section in newborn rats. For this purpose, two days old (P2) Wistar rats underwent left sciatic nerve section and were divided into two groups: (1) Tempol-treated group (24mg/kg) - 10 minutes and 6 hours, and every 24 hours after injury for up to 1 week; (2) Group Vehicle - Vehicle treated with the same dilution of Tempol. The animals of both groups were sacrificed at survival times of 8, 12, 24, 72 hours and one week after the lesion. The contralateral side of the spinal cord was used as internal control. After the respective days of survival, the animals were anesthetized and underwent thoracotomy for transcardial perfusion with saline and fixative. The assembly containing the lumbar intumescence and nerve roots were processed for subsequent preparation of histological sections. Cross sections of 12 ?m were used for evaluation of neuronal survival and TUNEL for the detection and quantification of apoptotic cells. The results showed that Tempol treatment increased the survival of motoneurons in the spinal cord 15% after 8 hours, 19% after 12 hours, 13% after 24 hours, 15% after 72 hours and 21% after one week post-lesion ( p <0.0001). Likewise, Tempol treated animals showed a decrease in the number of TUNEL positive cells, indicating reduction in apoptotic events. To further investigate the apoptotic events observed herein, we have performed qRT-PCR evaluation of bax, caspase3 and bcl2 transcript levels, 12 and 24 after injury. The results showed an increase in gene expression of 13, 3 and 28 times for bax, caspase 3 and bcl2, respectively, after 12 hours of axotomy and treatment with Tempol. After 24 hours no differences were observed relative to the control. As a whole, these results showed that Tempol is neuroprotective, leading to improved survival of motor neurons after peripheral nerve injury, minimizing the occurrence of apoptotic events