Orientador: Celso Eduardo Benedetti

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia...

Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia induzida pela bactéria. A patogenicidade de Xac é dependente do sistema secretório tipo III, que transloca proteínas efetoras pertencentes à família AvrBs3/PthA para dentro da célula hospedeira. Estudos recentes mostram que PthAs funcionam como fatores de transcrição no hospedeiro, transativando genes específicos da planta que irão beneficiar a bactéria ou desencadear uma resposta de defesa. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação de PthAs como ativadores da transcrição, nosso laboratório identificou, através da técnica de duplo-híbrido, várias proteínas de laranja (Citrus sinensis) que interagiram com diferentes PthAs. Entre elas, destacamos uma ciclofilina (CsCyp), que realiza isomerização de resíduos de prolina, uma proteína com domínio tioredoxina (CsTdx), relacionada com interação proteína-proteína e redução de pontes dissulfeto e uma cisteína protease (CsCP), envolvida na resposta de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de CsCyp. A resolução da estrutura de CsCyp mostrou que CsCyp pertence ao grupo de ciclofilinas divergentes que possuem um loop adicional (KSGKPLH), duas cisteínas invariáveis (C40 e C168) e um glutamato (E83) conservado. Este último interage com resíduos do loop, estabilizando-o. A função destes elementos era desconhecida até o momento e o trabalho visou elucidar sua atuação na regulação da atividade PPIase da proteína. Neste trabalho, verificamos que C40 e C168 formam uma ponte dissulfeto. Dados de modelagem e simulação suportaram a hipótese de que a formação da ponte dissulfeto induz mudanças conformacionais que quebram a interação do E83 com o loop divergente, levando ao fechamento do sítio ativo de CsCyp. O estudo descreveu, portanto um mecanismo de regulação redox, que controla a atividade PPIase da proteína. Adicionalmente, mostrou-se que CsTdx interage com CsCyp através dos resíduos conservados C40 e C168, sendo críticos para tal interação. Foi mostrado também que CsCyp interage com o domínio C-terminal (CTD) da RNA Polimerase II (RNA Pol II), especificamente com a repetição YSPSAP. Surpreendentemente, através da transformação de plantas com construções para silenciamento e superexpressão de CsCyp, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsCyp apresentaram um aumento dos sintomas do cancro cítrico quando infiltradas com Xac, enquanto que plantas com níveis aumentados de CsCyp apresentaram sintomas reduzidos quando infiltradas com Xac, indicando que CsCyp tem papel importante no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. Este trabalho também mostra a expressão e purificação das proteínas CsTdx e CsCP e a comprovação de que CsCP interage com PthAs 2 e 3 através de ensaios de duplo-híbrido

Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the...

Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the bacteria. Xac pathogenicity is dependent on a type III secretory system that translocates effector proteins which belongs to AvrBs3/PthA family inside the host cell. Recent studies showed that these proteins work as transcriptional factors that transactivate specific plant genes which will either benefit the bacteria or trigger defense response. To gain insights into PthA mechanism of action as transcription activators, our laboratory identified that PthA targeted the citrus protein complex comprising the thioredoxin CsTdx, ubiquitin-conjugating enzymes CsUev/Ubc13 and cyclophilin CsCyp. Also, we showed previously that the CsCyp binds the citrus thioredoxin CsTdx and the C-terminal domain of RNA Polymerase II (CTD), and that CsCyp complements the function of Cpr1 and Ess1, two yeast prolyl-isomerases that regulate transcription by the isomerization of proline residues of the regulatory C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. In this work we solved the 3D structure of CsCyp in complex with its inhibitor cyclosporine A (CsA), showing that CsCyp is a divergent cyclophilin that carries the additional loop KSGKPLH, invariable cysteines C40 and C168, and conserved glutamate E83. Despite the suggested roles in ATP and metal binding, the function of these unique structural elements remains unknown. Here we show that the conserved cysteines form a disulfide bond that inactivates the enzyme, whereas E83, which belongs to the catalytic loop and is also critical for enzyme activity, is anchored to the divergent loop to maintain the active site open. In addition, we demonstrate that C40 and C168 are required for the interaction with CsTdx and that CsCyp binds the citrus CTD YSPSAP repeat. Our data support the model where formation of the C40- C168 disulfide bond induces a conformational change that disrupts the interaction of the divergent and catalytic loops, via E83, causing the active site to close. This suggests a new type of allosteric regulation in divergent cyclophilins, involving disulfide bond formation and a loop displacement mechanism. Moreover, we present evidence that PthA2 inhibits the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity of CsCyp in a similar fashion as CsA, and that silencing of CsCyp, as well as treatments with CsA, enhance canker lesions in Xac-infected leaves. Given that CsCyp appears to function as a negative regulator of cell growth and that Ess1 negatively regulates transcription elongation in yeast, we propose that PthAs activate host transcription by inhibiting the PPIase activity of CsCyp on the CTD