Orientador: Hélia Harumi Sato

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: Transglutaminase é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações cruzadas intra- e intermoleculares entre proteínas, peptídeos e aminas primárias por meio de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina. Desta forma, transglutaminase pode ser utilizada em diversos setores...

Resumo: Transglutaminase é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações cruzadas intra- e intermoleculares entre proteínas, peptídeos e aminas primárias por meio de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina. Desta forma, transglutaminase pode ser utilizada em diversos setores industriais para o desenvolvimento de novos produtos ou para a modificação de suas características. A linhagem B6 isolada de amostra de solo coletada na região do Estado de Minas Gerais foi identificada como tendo características morfológicas típicas de actinomicetos e pela análise da região 16S rRNA há colocou na subclasse Streptomyces próximo a linhagem Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. A fim de aumentar a produção de transglutaminase (2,75 U/mL) pela linhagem Streptomyces sp. B6, o meio de fermentação foi submetido a processos de otimização. Como primeiro passo da otimização, o crescimento do micro-organismo e a produção da enzima foram estudados através de uma pré-seleção de fontes de carbono, nitrogênio e sais no meio de produção. Após as análises das diferentes fontes, um delineamento experimental do tipo Plackett-Burman foi utilizado para a seleção dos componentes do meio de cultivo que afetam a produção de transglutaminase. Os resultados do delineamento experimental indicaram que a produção de transglutaminase foi influenciada negativamente pela peptona bacteriológica e MgSO4.7H2O, positivamente pelo amido de batata, glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O e não foi influenciada pelo farelo de soja, considerando um nível de confiança de 95%. A concentração de amido de batata foi fixada no maior nível testado no planejamento Plackett-Burman devido à gelificação do meio de fermentação em concentrações maiores. Assim, os três fatores que influenciaram a produção de transglutaminase (glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O) foram otimizados para obter o máximo de produção da enzima utilizando delineamento composto central. Sob a condição otimizada, a qual continha 25 g/L de farinha de soja, 35 g/L de amido de batata, 5 g/L de glicose, 24,5 g/L de peptona de caseína e 8 g/L de KH2PO4.7H2O, a atividade enzimática atingiu 6,13 U/mL, apresentando 125% à mais de atividade em relação á obtida no meio antes da otimização. A transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. B6 exibiu atividade ótima em 45°C e em pH de 6,5 e 11,0. A enzima manteve-se estável na faixa de pH 3,0-11,0 durante 60 minutos à 40°C durante 3 horas. A transglutaminase não foi inibida por Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cisteína e glutationa na concentração de 5 mM, mas foi inibida na presença de Hg2+, Cu2+, Zn2+ e Fe2+ na concentração de 5mM. A linhagem Streptomyces sp. B6 é uma nova fonte de transglutaminase com características interessantes para aplicações biotecnológicas

Abstract: Transglutaminase is an enzyme capable of catalyzing the forming intra-and intermolecular cross-linking between proteins, peptides and primary amines by covalent bonds between lysine and glutamine residues. Thus, transglutaminase can be used in food processing industries to develop new...

Abstract: Transglutaminase is an enzyme capable of catalyzing the forming intra-and intermolecular cross-linking between proteins, peptides and primary amines by covalent bonds between lysine and glutamine residues. Thus, transglutaminase can be used in food processing industries to develop new products and modify their characteristics. The B6 strain was isolated from soil sample collected in the region state of Minas Gerais was identified as having morphological characteristics typical of the actinomycetes, and the 16S rRNA analysis placed it in the Streptomyces subclade, closely related to Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. In order to increase the transglutaminase production (2.75 U/mL) from Streptomyces sp. B6 strain, the fermentation medium was subjected to optimization processes. In the first step of optimization, the micro-organism growth and enzyme production were studied through a pre-selection of carbon, nitrogen and salts sources in the culture medium. After analysis of different sources, the Plackett¿Burman experimental design was used for screening the components of the culture medium that affect the transglutaminase production. Results of the experiment indicated that production of transglutaminase was negatively influenced by bacteriological peptone and MgSO4.7H2O, positively influenced by potato starch, glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O and was not influenced by soybean meal, considering 95% of confidence level. The potato starch concentration was fixed at the highest level tested in Plackett¿Burman design due to gelation of the fermentation medium in higher concentrations. Thus, the three factors that influence the transglutaminase production (glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O concentrations) were optimized to obtain the maximum transglutaminase production using central composite design. Under the proposed optimized condition, which contained 25 g/L soybean meal, 35 g/L potato starch, 5 g/L glucose, 24.5 g/L casein peptone and 8 g/L KH2PO4.7H2O, the enzyme activity reached 6.13 U/mL, which was 125% more than the activity in relative obtained medium before optimization. The microbial transglutaminase produced by Streptomyces sp. B6 strain exhibited optimal activity at 45 oC and at pH 6.5 and 11.0. The enzyme remained stable in the pH range from 3.0 - 11.0 for 60 minutes and at 40 oC temperature for 3 hours. The transglutaminase was not inhibited by Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cysteine and glutathione in concentration 5 mM, but was inhibited in the presence of Hg2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ in concentration 5 mM. In conclusion, Streptomyces sp. B6 strain is a new source of transglutaminase with interesting features for biotechnological applications