Orientador: Katia Borgia Barbosa Pagnano

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: O uso de inibidores de tirosinoquinases (TKIs) tem demonstrado eficácia no tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC). Porém, o fenômeno da resistência é um importante problema na prática clínica e ainda não está completamente elucidado. Além da presença de mutações no domínio quinásico...

Resumo: O uso de inibidores de tirosinoquinases (TKIs) tem demonstrado eficácia no tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC). Porém, o fenômeno da resistência é um importante problema na prática clínica e ainda não está completamente elucidado. Além da presença de mutações no domínio quinásico (DQ) do gene BCR-ABL, diversos mecanismos moleculares foram relacionados à resistência aos TKIs. Adicionalmente, alguns estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar assinaturas de expressão gênica associadas à resistência citogenética primária ao imatinibe (IM). Até o momento, a expressão de transcritos sem potencial codificador, mais especificamente de RNAs não codificadores longos (lncRNAs), ainda não foi investigada neste aspecto. LncRNAs, transcritos especialmente de regiões intrônicas, têm sido apontados recentemente como possíveis reguladores da expressão gênica em células normais e cancerosas. O objetivo geral deste estudo foi avaliar possíveis mecanismos de resistência ao tratamento com TKIs em pacientes com LMC, através da pesquisa de mutações no DQ do gene BCR-ABL e da identificação de genes codificadores e lncRNAs intrônicos diferencialmente expressos entre pacientes responsivos (R) e não responsivos (NR) ao IM e dasatinibe. A pesquisa de mutações realizada pela técnica de sequenciamento direto revelou que 37% (26/71) dos pacientes avaliados apresentavam mutações, sendo as mais frequentes T315I (25%), M244V (18%) e E255K/V (14%). As taxas de Sobrevida Global (SG) (p = 0,008), Sobrevida Livre de Progressão (p = 0,03) e Sobrevida Livre de Evento (SLE) (p = 0,006) foram menores para os pacientes com mutações. SG (p = 0,04) e SLE (p = 0,03) foram significativamente menores para os pacientes com a mutação T315I. A identificação de perfis de expressão gênica por microarranjos foi realizada a partir de amostras de células mononucleares de sangue periférico de 7 e 21 pacientes, respectivamente, para os estudos envolvendo dasatinibe e IM. Duas plataformas de microarranjos (Agilent Technologies) foram utilizadas neste estudo; a primeira com sondas que mapeiam exclusivamente em genes codificadores de proteína e a segunda, customizada, com 44.000 elementos que mapeiam em regiões intrônicas e exônicas de mesmo locus. As análises estatísticas foram realizadas com as técnicas Significance Analysis of Microarrays e patient leave-one-out cross-validation. Genes codificadores de proteína e lncRNAs diferencialmente expressos foram identificados a partir de comparações de três subgrupos de amostras de R e NR, pré e pós-tratamento. Em seguida, cada conjunto de transcritos diferencialmente expressos foi analisado através do programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para a identificação de funções biológicas, redes gênicas e vias canônicas significativamente enriquecidas. Entre os transcritos encontrados como diferencialmente expressos entre R e NR estão ABCF2, PAWR, ncCD44, ncTNFAIP8 e ncFOXO3A no estudo com dasatinibe e LEF1, BCL2, FYN, ncPXN, ncNCAM1 e ncRASEF no estudo com IM. Porém, no estudo com IM, os conjuntos de transcritos diferencialmente expressos não distinguiram totalmente os casos R e NR. O presente trabalho identificou transcritos diferencialmente expressos entre amostras de pacientes R e NR tratados com dasatinibe e MI e sugere que lcnRNAs possuem um importante papel nos mecanismos moleculares de resistência. Futuras investigações serão necessárias para a confirmação destes achados

Abstract: The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has demonstrated efficacy in treating chronic myeloid leukemia (CML). However, resistance is an important problem in clinical practice and it has not yet been completely elucidated. Besides mutations within the BCR/ABL kinase domain (KD),...

Abstract: The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has demonstrated efficacy in treating chronic myeloid leukemia (CML). However, resistance is an important problem in clinical practice and it has not yet been completely elucidated. Besides mutations within the BCR/ABL kinase domain (KD), diverse molecular mechanisms have been proposed to account for resistance to TKIs. Furthermore, some studies have been performed in order to identify gene expression signatures associated with primary cytogenetic resistance to imatinib (IM). So far, non-protein-coding RNAs expression, more specifically long non-coding RNAs (lncRNAs) expression, has not been investigated in this aspect. LncRNAs, especially those transcribed from intronic regions, have recently been suggested as potential regulators of gene expression in normal and cancer cells. The aim of this study was to evaluate possible mechanisms of resistance to TKI treatment in CML patients by performing BCR-ABL mutation analysis and identifying differentially expressed protein-coding genes and intronic lncRNAs in responder (R) and non-responders (NR) patients to IM and dasatinib. Mutation analysis performed by direct sequencing identified mutations in 37% (26/71) of the analyzed patients; the three most frequently detected mutations were T315I (25%), M244V (18%) and E255K/V (14%). Overall survival (OS) (p = 0.008), progression-free survival (p = 0.03) and event-free survival (EFS) (p = 0.006) rates were worse for patients harboring mutations. OS (p = 0.04) and EFS (p = 0.03) were significantly worse for T315I patients. Microarray expression profiling was performed on peripheral blood mononuclear cells from 7 and 21 patients, respectively, for the dasatinib and IM studies. Two array platforms (Agilent Technologies) were used in this study: the first one with probes exclusively mapping to protein-coding genes; the second, a custom-designed 44K oligoarray containing probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses were performed with Significance Analysis of Microarrays and patient leave-one-out cross-validation techniques. Differentially expressed protein-coding genes and lncRNAs were identified by comparing three subgroups of pre- and post-treatment samples from R and NR. Next, each set of differentially expressed transcripts was analyzed by using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software for identifying significantly enriched biological functions, gene networks and canonical pathways. Amongst the transcripts found as differentially expressed between R and NR are ABCF2, PAWR, ncCD44, ncTNFAIP8, and ncFOXO3A in the dasatinib study and LEF1, BCL2, FYN, ncPXN, ncNCAM1, and ncRASEF in the IM study. Nevertheless, in the IM study, the sets of differentially expressed transcripts were not capable of entirely distinguishing between responder and non-responders cases. In the present study differentially expressed transcripts between responder and non-responders' samples treated with dasatinib and IM were identified, and it suggests that lncRNAs play an important role in the molecular mechanisms of resistance. Further investigations are necessary to confirm these findings