Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e...

Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e aprofundar a investigação de substâncias bioativas em extratos de organismos marinhos, junto ao IQSC-USP/Projeto temático, realizando bioensaios de atividade antiviral no laboratório de virologia da Unicamp. Com o objetivo de realizar uma triagem para pesquisar substâncias com ação antiviral, foram eleitas duas espécies de vírus de destaque na avicultura, o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus da Doença de Newcastle (NDV), representantes da família Paramyxoviridae. As propriedades em comum dos vírus dentro das respectivas subfamílias, como a organização genômica, sequências das proteínas e suas atividades biológicas, permitem a utilização do aMPV como modelo de estudo para importantes agentes infecciosos da subfamília Pneumovirinae, e o NDV da subfamília Paramyxovirinae. Para a triagem de compostos antivirais foi realizada a avaliação in vitro na linhagem celular Chicken Embryo Related (CER) para a propagação dos vírus e analisar os resultados de inibição viral frente a diferentes extratos e substâncias. Dos cento e vinte e cinco extratos testados frente ao aMPV, sete demonstraram ser ativos, e seis com alto potencial antiviral. Inicialmente, cento e quarenta e sete extratos foram testados frente ao NDV, porém, o resultado foi inconclusivo devido a problema com o título da amostra viral. Assim, os sete extratos ativos e os seis com alto potencial antiviral contra o aMPV foram testados quanto à capacidade de inibição do NDV. Apesar das similaridades dos vírus da família Paramyxoviridae, os extratos não tiveram atividade contra o NDV, como ocorreu frente ao aMPV. As amostras ativas foram estudadas em três tipos de tratamento a fim de determinar os possíveis mecanismos de ação dos extratos: Pré-tratamento, fases de adsorção e/ou penetração do vírus na célula; Pós-tratamento, etapas intracelulares de replicação do vírus; e Inativação Viral. Pela análise visual do efeito citopático, os sete extratos ativos contra aMPV, quatro interrompem as etapas intracelulares de replicação do vírus, dois agem nas fases de adsorção e/ou penetração do vírus à célula, e um não tinha quantidade suficiente para realizar o teste. Com a finalidade de avaliar os possíveis mecanismos de ação com maior objetividade, menor risco de contaminação e alta especificidade, testou-se a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Utilizando um composto puro (pirocina A) frente ao aMPV em CER, a metodologia se demonstrou eficiente. Esse dado foi confirmando pela diminuição de RNA viral quando ocorre a atividade antiviral, dando indícios de atuação do composto em etapas intracelulares de replicação do aMPV. A detecção de extratos com atividade antiviral nas situações testadas neste trabalho corrobora o valor da biodiversidade marinha como fonte de produtos promissores na terapêutica de enfermidades virais. Portanto, a necessidade de estudos sobre esses vírus e do desenvolvimento de novos insumos a serem utilizados nos seus controles é de grande importância ponderado a crescente projeção da indústria avícola brasileira no comércio mundial

Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of...

Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of marine organisms, with the IQSC-USP group, performing bioassays antiviral activity in the laboratory of virology at Unicamp. In order to perform a screening to search antiviral substances were elected two species prominent in poultry, the avian Metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV), representatives of the family Paramyxoviridae. The common properties of the virus within their respective subfamilies, such as genomic organization, sequences of proteins and their biological activities, allow the use of aMPV as a study model for important infectious agents of Pneumovirinae subfamily, and NDV Paramyxovirinae subfamily. For antiviral screening, compounds were tested in vitro using Chicken Embryo Related (CER) cell lineage for the propagation of the virus and analyze the results of viral inhibition against various substances. Among one hundred twenty five extracts tested against aMPV, seven were actives and six have been shown high antiviral potential against the virus. Initially, one hundred fourty seven extracts were tested against NDV. However, the result was inconclusive due to problems with the titer of the viral sample. Thus, the seven active extracts and six extracts with high antiviral potential against the aMPV were tested for the ability to inhibit NDV. Despite the similarities of viruses of the family Paramyxoviridae, the extracts had no activity against NDV, as occurred against aMPV. The active samples were studied in three types of treatment in order to determine the possible mechanisms of action of the extracts: Pre-treatment, stages of adsorption and / or penetration of the virus into the cell; Post-treatment, intracellular steps of virus replication; and Viral Inactivation. At visual analysis of cytopathic effect, from all 7 extracts active against aMPV, 4 disrupt intracellular steps of virus replication, 2 acts on adsorption and / or penetration stages of the virus into the cell, and 1 was not enough to perform the test. In order to assess the possible mechanisms of action more objectively, lower contamination risk and high specificity, the polymerase chain reaction (PCR) in real time methodology was tested. Using a pure compound (pirocina A) against aMPV in CER cell lineage, the methodology is demonstrated efficient. This was confirmed by the decrease of viral RNA when occurs antiviral activity, an evidence of compound's action on intracellular steps of aMPV replication. The detection of extracts with antiviral activity in this study confirms the value of marine biodiversity as a source of promising products in the viral diseases therapeutic. Therefore, the primordiality for more studies and the development of new inputs to control these viruses is extremely important to increasing of Brazilian poultry industry in world trade