Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: As chaperonas moleculares estão envolvidas na manutenção da homeostase celular, auxiliando no correto enovelamento de proteínas, e consequentemente em sua funcionalidade. Duas famílias de chaperonas moleculares participam de pontos-chave neste sistema. Uma delas é a Hsp100 que tem papel...

Resumo: As chaperonas moleculares estão envolvidas na manutenção da homeostase celular, auxiliando no correto enovelamento de proteínas, e consequentemente em sua funcionalidade. Duas famílias de chaperonas moleculares participam de pontos-chave neste sistema. Uma delas é a Hsp100 que tem papel importante na desagregação de proteínas; a outra é a Hsp90 que tem o papel de auxiliar no enovelamento, ativação, e na translocação de proteínas regulatórias e sinalizadoras. Neste trabalho foram caracterizadas as chaperonas Hsp100 e Hsp90 de cana-de-açúcar, denominadas SHsp101 e SsHsp90, respectivamente, cuja expressão em níveis basais foi detectada em tecido foliar. As proteínas recombinantes foram produzidas em Escherichia coli, de maneira solúvel, e após purificação apresentaram-se enoveladas. A SHsp101 foi obtida como um hexâmero em solução, apresentando capacidade de ligar nucleotídeos ATP e ADP, e de hidrolisar o ATP de maneira alostérica com cooperatividade positiva; mas não foi capaz de hidrolisar o ADP, que por sua vez mostrou-se inibidor da atividade ATPásica. A SHsp101 exibiu atividades de proteção do substrato luciferase contra agregação induzida por alta temperatura e de desagregação e reenovelamento da proteína-modelo GFPuv, na presença de ATP e ATP?S. Análises de complementação in vivo revelaram que a superexpressão heteróloga de SHsp101 em cepas de levedura mutantes nulo de hsp104, aumentou a termotolerância a 53°C, proporcionando um aumento de 80 vezes na sobrevivência das leveduras. A SsHsp90 apresentou-se dimérica em solução, com características estruturais e conformacionais (modelo tridimensional gerado por modelagem comparativa e validado por meio de análises de ligação cruzada acoplada à espectometria de massas) semelhantes às homólogas de outros organismos. A SsHsp90 apresentou atividade chaperona de proteção contra agregação da proteína-modelo citrato sintase desnaturada por choque térmico. As informações acerca da expressão, estrutura, e função de SHsp101 e SsHsp90 obtidas neste trabalho, contribuem para um melhor entendimento destas famílias de chaperonas moleculares, particularmente em plantas, que por serem organismos sésseis, estão mais expostos às condições adversas do ambiente

Abstract: Molecular chaperones are involved in the maintenance of cellular homeostasis by promoting the correct folding of proteins, and consequently, ensuring their functionality. Two families of molecular chaperones participate at key points in this system. The first is Hsp90, which assists in...

Abstract: Molecular chaperones are involved in the maintenance of cellular homeostasis by promoting the correct folding of proteins, and consequently, ensuring their functionality. Two families of molecular chaperones participate at key points in this system. The first is Hsp90, which assists in protein refolding, activation, and the trafficking of regulatory and signaling proteins, while the second is Hsp100, which has an important role in protein disaggregation. In this study, the Hsp90 and Hsp100 proteins from sugarcane were characterized, denoted as SsHsp90 and SHsp101, respectively, and their basal level of expression was detected in leaf tissue. In addition, both were produced by Escherichia coli as soluble form and then they were purified in a folded state. The SHsp101 was obtained folded as hexamer in solution and showed capacity of bind both ATP and ADP, but could only hydrolyze ATP in an allosteric manner with positive cooperativity. In fact, the presence of ADP had an inhibitory effect on the ATPase activity. SHsp101 exhibited protection against aggregation of luciferase, and showed a disaggregation and refolding activity of GFPuv in the presence ATP and ATP?S. In vivo complementation analysis revealed that heterologous overexpression of SHsp101 in a null hsp104 yeast strain correlated with an 80 fold increase in yeast survival at 53°C. The dimer obtained for SsHsp90 had similar structural and conformational characteristics compared to other Hsp90 homologues, and was compatible with a three-dimensional model generated by comparative modeling, which was validated by cross-linking coupled to mass spectrometry. The SsHsp90 protected against thermal aggregation of citrate synthase. Taken together, the information about the expression, structure, and function of SHsp101 and SsHsp90 obtained in this study contribute to a better understanding of these molecular chaperone protein families, particularly in plants, which are sessile organisms and more exposed to adverse environmental conditions