Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Fábio Márcio Squina

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande...

Resumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande quantidade de energia estocada nessas matérias-primas. O etanol de cana-de-açúcar é uma das melhores opções em biocombustíveis e sua produção pode mais que dobrar, se os açúcares constituintes da parede celular vegetal forem utililizados. No entanto, o alto custo de produção das enzimas para hidrolisar e processar os materiais lignocelulósicos é um fator altamente limitante para o uso de tecnologias verdes. Este trabalho se propôs a avaliar novos biocatalisadores e construir uma enzima quimérica na tentativa de obter glicosidases com melhor desempenho que as já relatadas. Enzimas despolimerizadoras de ß-1,3-glucanos têm consideráveis aplicações biotecnológicas, incluindo produção de biocombustíveis, insumos químicos e farmacêuticos. No segundo capítulo, mostramos a caracterização funcional e a estrutura de baixa resolução da laminarase hipertermofílica de Thermotoga petrophila (TpLam), além de seu modo de operação por eletroforese capilar de zona, mostrando que ela cliva especificamente ligações ß-1,3-glucosídicas internas. O dicroismo circular (CD) UV-distante demonstrou que TpLam é formada principalmente por elementos estruturais do tipo beta, e a estrutura secundária é preservada após incubação por 16 horas a 90 º C. A forma determinada pelo pequeno espalhamento de raios-X a baixo ângulo revelou uma arquitetura de multi-domínio da enzima, com um arranjo de envelope em forma de V, no qual os dois módulos de ligação de carboidrato estão ligados ao domínio catalítico. A engenharia de enzimas multifuncionais pode melhorar coquetéis enzimáticos para tecnologias emergentes de biocombustíveis. Dinâmica molecular através de modelos baseados em estrutura (SB) é uma ferramenta eficaz para avaliar a disposição tridimensional das enzimas quiméricas, bem como para inferir a viabilidade funcional antes da validação experimental. No terceiro capítulo, descrevemos a montagem computacional de uma quimera bifuncional xilanase-liquenase (XylLich), usando os genes xynA e bglS de Bacillus subtilis. As análises in silico da área de superfície acessível ao solvente (SAS) e da raiz quadrada média das flutuações (RMSF) previram uma quimera completamente funcional, ou seja, uma enzima cujo substrato tem acesso ao seu sítio catalítico com pequenas flutuações e variações ao longo das cadeias polipeptídicas. A quimera preservou as características bioquímicas das enzimas parentais, com exceção de uma pequena variação na temperatura de operação e na eficiência catalítica (kcat / Km). Também foi verificado ausência de mudanças significativas no modo de operação catalítico. Além disso, a produção de enzimas quiméricas pode ser mais rentável do que a produção de uma única enzima separadamente, comparando-se o rendimento da produção de proteína recombinante e a atividade hidrolítica da enzima quimérica com as enzimas parentais. ß-Glicosidases (BGLs) são enzimas muito úteis e com grande potencial para serem empregadas em diversos processos industriais. Entretanto, algumas características são essenciais para tornar viáveis as aplicações, como por exemplo estabilidade à temperatura e ao pH, bem como baixa inibição por íons e outros compostos químicos. Assim, no quarto capítulo buscamos estudar três BGLs dos organismos extremófilos Pyrococcus furiosus e Thermotoga petrophila. Os genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 foram clonados no vetor pET28a e as proteínas expressadas em Escherichia coli e posteriormente purificadas em duas etapas cromatográficas. As enzimas purificadas foram avaliadas quanto ao pH e temperatura de atividade, sendo que as BGLs da família GH1 (PfBgl1 e TpBgl1) apresentaram faixas mais largas de pH e temperatura de operação do que a família GH3 (TpBgl3). As BGLs mostraram grande estabilidade ao pH e o maior tempo de meia-vida (a 99 ° C) foi verificado no pH 6, e além disso, não foram significativamente afetadas pela presença de EDTA ou de íons, exceto a TpBgl1 que foi inibida por Hg2+ e Fe2+. As atividades específicas para um conjunto de diferentes substratos sugeriram que TpBgl3 é mais específica que as BGLs GH1. O kcat e kcat / Km em 4-nitrofenol-ß-D-glicopiranosídeo (pNPG) indicam que TpBgl3 é a mais eficiente para hidrólise do substrato, embora seja a enzima que foi inibida com a menor concentração de glicose (30.1 mM). Além disso, as BGLs foram analisadas quanto à influência de seis monossacarídeos na catálise, e demonstraram serem fracamente inibidas pela maioria dos açúcares testados. Os ensaios de CD UV-distante revelaram que a estrutura secundária das BGLs não é afetada pelas variações de pH, e os estudos de desnaturação térmica evidenciaram que as BGLs são proteínas hipertermofílicas

Abstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials....

Abstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials. The ethanol from sugarcane is one of the best options concerning biofuels and its productivity could be raised more than double if the use of sugars constituents of plant cell wall is considered. However the high production cost of the enzymes to hydrolyze and process lignocellulose is a great limiting factor for green technologies. In this way, this work proposed to evaluate new enzymes and engineer a chimeric enzyme in the attempt to prospect glycosyl hydrolases with better performance than those reported up to date. 1,3-ß-Glucan depolymerizing enzymes have considerable biotechnological applications including the production of biofuels, feedstock-chemicals and pharmaceuticals. In the first chapter we showed the comprehensive functional characterization and low-resolution structure of hyperthermophilic laminarase from Thermotoga petrophila (TpLam), besides its mode of operation through capillary zone electrophoresis, which specifically cleaves internal ß-1,3-glucosidic bonds. Far-UV circular dichroism demonstrated that LamA is formed mainly by beta structural elements, and the secondary structure is maintained after incubation up to 16 hours at 90ºC. The structure determined by small angle X-ray scattering revealed a multi-domain structural architecture of the enzyme with a V-shape envelope arrangement of the two carbohydrate binding modules in relation to the catalytic domain. Multifunctional enzyme engineering can improve enzyme cocktails for emerging biofuel technology. Molecular dynamics through structure-based models (SB) is an effective tool for assessing the tridimensional disposal of chimeric enzymes as well as for inferring the functional practicability before experimental validation. In the second chapter we describe the computational design of a bifunctional xylanase-lichenase chimera (XylLich) using the xynA and bglS genes from Bacillus subtilis. In silico analysis of the average surface accessible area (SAS) and the root mean square fluctuation (RMSF) predicted a fully functional chimera, i.e. the substrate has access to the catalytic pocket with minor fluctuations and variations along the polypeptide chains. The chimera preserved the biochemical characteristics of the parental enzymes, with the exception of a slight variation in the temperature of operation and the catalytic efficiency (kcat/Km). The absence of substantial shifts in the catalytic mode of operation was also verified. Furthermore, the production of chimeric enzymes could be more profitable than producing a single enzyme separately, based on comparing the recombinant protein production yield and the hydrolytic activity achieved for XylLich with that of the parental enzymes. ß-Glucosidases (BGLs) are very useful enzymes with a great potential to be employed in several industrial processes. However, some features are required to become viable the enzyme applications, such as temperature and pH stability as well, low ions and chemicals inhibition. Thus this work aimed to study three BGLs from the extremophiles organisms Pyrococcus furiosus and Thermotoga petrophila. The genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 were cloned into pET28a vector and the proteins were expressed in Escherichia coli and further purified in two chromatographic steps. The purified enzymes were evaluated for pH and temperature of activity, which showed that BGLs from the glycosyl hydrolases family 1 (PfBgl1, TpBgl1) presented a wider range of pH and temperature operation than BGL from family 3 (TpBgl3). The BGLs showed great stability to a range of pH (4-10) and the highest time of half-life (at 99 °C) was at pH 6, besides they were not significantly affected by the presence of EDTA or ions, except TpBgl1 that was inhibited by Hg2+ and Fe2+. The specific activities in a set of different substrates suggested that TpBgl3 is more specific than GH1 BGLs. The kcat and kcat/Km in pNPG indicate that TpBgl3 is the most efficient among BGLs characterized herein, although this enzyme is inhibited with the lowest glucose concentration (30.1 mM). Furthermore, the BGLs were assayed for influence of six monosaccharides in catalysis, which the results suggested a weak inhibition by the most of those carbohydrates tested. The CD experiments revealed that the secondary structure of BGLs is not affected by the pH variations and the denaturation studies evidenced that the BGLs are indeed hyperthermophilic