Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: Abscessos apicais agudos são condições frequentes na urgência endodôntica. São infecções polimicrobianas que apresentam variações entre indivíduos, e afetam o sistema de canais radiculares e tecidos periapicais. Associações bacterianas podem ser importantes, agindo sinergicamente e...

Resumo: Abscessos apicais agudos são condições frequentes na urgência endodôntica. São infecções polimicrobianas que apresentam variações entre indivíduos, e afetam o sistema de canais radiculares e tecidos periapicais. Associações bacterianas podem ser importantes, agindo sinergicamente e aumentando sua virulência, o que agrava os danos causados no hospedeiro. Considerando a etiologia microbiana das alterações pulpares e periapicais, é de fundamental importância identificar corretamente as bactérias presentes nas infecções endodônticas. Métodos moleculares de identificação bacteriana, baseados no sequenciamento do gene 16S rRNA, são importantes e fornecem uma identificação mais fiel que métodos fenotípicos. Estudos metagenômicos são ideais para avaliação da diversidade bacteriana, possibilitando identificação de espécies que se acreditava não estarem sendo cultivadas, ou encontrar espécies que ainda não foram encontradas ou associadas com infecções endodônticas, incluindo espécies ainda não cultiváveis. O objetivo deste estudo foi investigar a diversidade bacteriana de canais radiculares de dentes com abscesso apical agudo por cultura, clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA, compararando a efetividade dos métodos. Foram feitas coletas microbiológicas de 20 canais radiculares utilizando cones de papel absorvente estéreis, transportados em meio VMGA III. Um total de 220 cepas isoladas, identificadas previamente por métodos bioquímicos, foram submetidas à extração de DNA, amplificação do gene 16S rRNA seguido de sequenciamento. Além disso, 10 das 20 amostras coletadas foram também submetidas à clonagem bacteriana através de Escherichia coli DH5? eletrocompetentes. As sequências de nucleotídeos obtidas foram comparadas com o banco de dados do National Center of Biotechnology Information através do BLAST. Trinta e quatro espécies diferentes foram identificadas bioquimicamente e 57 pelo sequenciamento, numa média de 6 espécies por canal. O sequenciamento permitiu identificação de 97% das bactérias isoladas (215), enquanto apenas 70,5% foram identificadas bioquimicamente (155). A concordância entre os métodos de identificação fenotípica e genotípica foi de 49% e as cepas não identificadas bioquimicamente (65/220) foram caracterizadas em 97% (63/65) pelo sequenciamento. As bactérias mais frequentemente identificadas pelo sequenciamento foram Prevotella spp., Pseudoramibacter alactolyticus, Parvimonas micra, Dialister invisus, Filifactor alocis e Peptostreptococcus stomatis. Um total de 689 clones foi analisado e 76 filotipos foram identificados, numa média de 15 por canal. Quarenta e oito espécies diferentes foram identificadas e 28 (36,84%) filotipos representados por espécies ainda não cultivadas ou não caracterizadas. Prevotella spp., Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis e Peptostreptococcus stomatis, foram às espécies mais frequentemente identificadas, seguidas por Dialister invisus, Parvimonas micra, Phocaeicola abscessus, Porphyromonas spp. e Lachnospiraceae oral clone. Nenhuma espécie foi encontrada em todos os casos estudados, e algumas estavam presentes em apenas 1 caso. Métodos que independem da cultura mostram que a microbiota endodôntica pode ser subestimada por estudos cultura-dependentes. Apesar de algumas espécies serem predominantes em infecções endodônticas primárias, como as anaeróbias Gram-negativas, concluímos que esta infecção é bastante complexa e heterogênea, caracterizada por uma grande diversidade bacteriana. A associação de métodos convencionais e moleculares permite um conhecimento mais acurado da microbiota endodôntica

Abstract: Acute apical abscesses are one of the most frequently treated conditions in endodontic emergency. It is a microbiologically heterogeneous disease presenting different bacterial profiles among the patients. Multiple bacterial combinations play a role in disease, acting synergistically and...

Abstract: Acute apical abscesses are one of the most frequently treated conditions in endodontic emergency. It is a microbiologically heterogeneous disease presenting different bacterial profiles among the patients. Multiple bacterial combinations play a role in disease, acting synergistically and increasing their virulence, which leads to further damage to the host. Considering the microbial etiology of pulp and periapical disease, it is important to identify correctly microorganisms present in acute endodontic infection. Molecular methods of bacterial identification based on the 16S rRNA gene sequencing represent an important tool for identification and determination of the taxonomic position of microorganisms. The assessment of the endodontic microbiota by metagenomic approaches revealed that these techniques are sensitive and specific to evaluate the bacterial diversity of root canal infections, making possible the identification of some unexpected or not often associated with endodontic infection, including as-yet-uncultivated. The aim of this study was to investigate the bacterial diversity in the root canals of teeth with APA by culture, clonal analysis and 16S rRNA sequencing. Microbial samples were taken from 20 root canals using sterile paper points which were immediately placed into the VMGA III transport medium. A total of 220 isolated strains, previously identified by biochemical methods, were submitted to DNA extraction, 16S rRNA gene amplification and sequencing. Ten out of the 20 samples collected were also subjected to the clonal analysis using electrocompetent Escherichia coli DH5?. The nucleotides sequences obtained were compared with the GenBank database from National Center of Biotechnology Information through the BLAST. Thirty-four different bacteria were identified biochemically and 57 by 16S rRNA sequencing, in an average of 6 species per root canal. Sequencing allowed the identification of 97% of isolates against 70.5% identified biochemically. There was an agreement of 49% between the biochemical and 16S rRNA gene sequencing identification. Strains not identified biochemically (65/220) were characterized in 97% (63/65) by sequencing. The most frequently identified bacteria by sequencing were Prevotella spp., Pseudoramibacter alactolyticus, Parvimonas micra, Dialister invisus, Filifactor alocis and Peptostreptococcus stomatis. A total of 689 clones were analyzed and 76 phylotypes identified, of which 48 (63.15%) were different species and 28 (36.84%) were taxa reported as-yet-uncultivable or as yet-uncharacterized species. Prevotella spp., Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis and Peptostreptococcus stomatis, were the most frequently detected species, followed by Dialister invisus, Parvimonas micra, Phocaeicola abscessus, Porphyromonas spp. and the uncharacterized Lachnospiraceae oral clone. No specie was detected in all studied samples and some species were identified in only one case. Culture-independent methods shown that endodontic microbiota was underestimated in culture studies. Although some species predominate in acute primary endodontic infections, it was concluded that this infection is microbiologically heterogeneous, characterized by a wide diversity in which anaerobic gram-negatives are most frequently, and that the association of conventional and molecular approaches allow a better understanding of these microorganisms