Orientador: Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, Mario Fernando de Góes

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: Para o entendimento do processo de adesão à dentina é fundamental conhecer a estrutura bioquímica e biomecânica deste substrato em condições normais ou quando submetido às diferentes etapas do procedimento restaurador adesivo. Evidências indicam que a reportada degradação da camada híbrida...

Resumo: Para o entendimento do processo de adesão à dentina é fundamental conhecer a estrutura bioquímica e biomecânica deste substrato em condições normais ou quando submetido às diferentes etapas do procedimento restaurador adesivo. Evidências indicam que a reportada degradação da camada híbrida pode ocorrer pela ação de enzimas proteolíticas, pertencentes à família das metaloproteinases da matriz (MMPs) e das cisteíno-catepsinas (CTs). No entanto, é ainda necessário elucidar as funções biológicas dessas enzimas nesse processo, bem como, definir uma estratégia para prolongar a durabilidade das restaurações adesivas. O presente estudo teve como objetivo caracterizar o perfil proteolítico da dentina humana frente a sua exposição a diferentes concentrações de digluconato de clorexidina (CHX), um potente inibidor da atividade de MMPs. O efeito da CHX sobre a atividade proteolítica intrínseca da dentina foi avaliado a partir da análise do comportamento mecânico e bioquímico da matriz dentinária e da durabilidade de restaurações adesivas. No primeiro estudo, foi analisada a capacidade da CHX em inibir a atividade das CTs (B, K e L) por hidrólise de substratos fluorogênicos específicos, verificando a afinidade de ligação entre a CHX e as enzimas. No segundo estudo, o tratamento da matriz de dentina com diferentes concentrações de CHX foi avaliado pela análise do módulo de elasticidade e do grau de hidrólise do colágeno (liberação de hidroxiprolina) após armazenagem das amostras em solução fisiológica por 1 dia, 7 ou 30 dias. Finalmente, a função terapêutica da CHX como agente inibitório da atividade proteolítica da dentina foi investigada a partir de sua capacidade em preservar a integridade mecânica (resistência de união) e morfológica de interfaces adesivas tratadas com diferentes concentrações de CHX (0,2; 2,2 e 22 mM) e armazenadas por 6 a 18 meses. No terceiro estudo, a presença das CT-B e CT-K na dentina humana foram avaliadas por imunomarcação em MEV e MET. A atividade enzimática das MMPs e CTs na dentina e uma possível interação entre as duas famílias de enzimas foram verificadas por zimografia in situ e por espectrofluorimetria. Os resultados mostraram, de forma até então inédita, que a CHX é um potente inibidor das CTs presentes no complexo dentino-pulpar. No entanto, a CHX não foi capaz de preservar integralmente o módulo de elasticidade (E) da matriz dentinária após o período mais longo de armazenagem. De modo similar, maior grau de hidrólise do colágeno ocorreu após 30 dias de armazenamento para as amostras que não foram tratadas com CHX ou que foram tratadas com baixa concentração da mesma (0,2 mM) (p<0,05). Notavelmente, o grau de hidrólise do colágeno foi mínimo ou insignificante quando a matriz dentinária foi tratada com concentração mais elevada de CHX (22 mM) (p>0,05). A CHX não afetou a resistência de união imediata da interface adesiva e preservou a resistência da união dentina/resina mesmo após 6 ou 18 meses de armazenamento. Similarmente, menor grau de nanoinfiltração com prata, significando maior integridade morfológica, foi observado para os espécimes tratados com CHX e envelhecidos por 6 ou 18 meses em comparação com as amostras do grupo controle. As imagens de imuno-histoquímica mostraram que as proteases CT-B e CT-K estão presentes na dentina humana, e não apenas na região de pré-dentina e interior dos túbulos dentinários como anteriormente antecipado. A zimografia in situ sugere que a atividade gelatinolítica das MMPs na dentina parece ser preponderante em relação à atividade das CTs, embora a espectrofluorimetria sugira que a atividade proteolítica de ambas as famílias de enzimas esteja presente no tecido dentinário. Dessa forma, concluiu-se que MMPs e CTs podem atuar sinergicamente na degradação da matriz orgânica dentinária, mas que parte dessa atividade proteolítica pode ser controlada pela presença de CHX, sobretudo, se essa estiver confinada no interior da camada híbrida

Abstract: To better understand the process of adhesion to dentin is essential to understand the biochemical and biomechanical structures of this substrate under normal conditions or when subjected to the different steps of the adhesive restorative procedure. Evidences indicate that the hybrid layer...

Abstract: To better understand the process of adhesion to dentin is essential to understand the biochemical and biomechanical structures of this substrate under normal conditions or when subjected to the different steps of the adhesive restorative procedure. Evidences indicate that the hybrid layer degradation can result from the activity of proteolytic enzymes, belonging to the family of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine-cathepsins (CTs). However, it is still necessary to comprehend the role of these enzymes in this degrading process as well as to determine the best way to extend the durability of adhesive restorations. The general purpose of the present study was to characterize the human dentin proteolytic profile when exposed to different concentration of chlorhexidine digluconate (CHX), a potent inhibitor of MMPs activity. The effect of CHX on the dentin endogenous proteolytic activity was evaluated by the analysis of dentin matrix mechanical and biochemical properties and adhesive restorations durability. The first study evaluated the CHX ability to inhibit CTs (B, K and L) activity by the hydrolysis of fluorogenic substrates, verifying the binding affinity between CHX and enzymes. The dentin matrix treatment with different CHX concentrations was evaluated in the second study by the elastic modulus (E) and degree of collagen hydrolysis (hydroxyproline release) after storage for 1, 7 or 30 days in saline solution. Finally, the CHX therapeutic action as an inhibitor of dentin proteolytic activity was investigated by its ability to maintain the mechanical (bond strength) and morphological (nanoleakage) properties of adhesive interfaces treated with different CHX concentrations (0.2, 2.2 and 22 mM) after aging for 6 to 18 months. The third study evaluated the presence of CT-B and CT-K in human dentin using immunolabeling in SEM and TEM. MMPs and CTs proteolytic activities and a possible interaction between these two families were verified by in situ zymography and by spectrofluorimetry. Results showed, for the first time, that the CHX is a potent inhibitor of CTs in the pulp-dentin complex. However, CHX was not able to preserve the integrity of the dentin matrix E after the longest storage period. Likewise, higher collagen hydrolysis occurred after 30 days of storage when the samples were not treated or treated with low CHX concentration (0.2 mM) (p<0.05). It was noticeable that the collagen hydrolysis was minimum or insignificant when the dentin matrix was treated with the highest CHX concentration (22 mM) (p>0.05). CHX did not affect the immediate bond strength of adhesive interfaces and preserved the resin/dentin bond strength even after 6 or 18 months of storage. Similarly, less nanoleakage with silver particles, which means better morphological integrity, was observed for specimens treated with CHX and aged for 6 or 18 months in comparison with control samples. Immunohistochemistry images showed that the proteases CT-B and CT-K are present in human dentin matrix, not only in pre-dentin region and inside the dentin tubules as previous suggested. In situ zymography suggests that the MMPs gelatinolytic activity in dentin seems to be predominant when compared to CTs activities, although the spectrofluorimetry suggests that the proteolytic activity of both families of enzymes are present in dentin. In this way, it was concluded that MMPs and CTs may synergistically act in the dentin organic matrix degradation, but part of this proteolytic activity can be controlled by the presence of CHX, especially when it is restrained inside the hybrid layer