Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e...

Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético

Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose...

Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance