Orientadores: Telma Teixeira Franco, Ana Carolina Deckmann

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o melhoramento genético da linhagem de levedura Lipomyces starkeyi DSM 70296, visando sua utilização na biossíntese de precursores de biocombustíveis a partir de fontes renováveis. Inicialmente foram verificados os parâmetros de mutagênese....

Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o melhoramento genético da linhagem de levedura Lipomyces starkeyi DSM 70296, visando sua utilização na biossíntese de precursores de biocombustíveis a partir de fontes renováveis. Inicialmente foram verificados os parâmetros de mutagênese. O melhoramento genético foi conduzido por mutagênese aleatória de DNA por irradiação ultravioleta. O tempo de exposição foi ajustado de forma a assegurar uma taxa de sobrevivência celular não superior a 5%, para obter indivíduos contendo elevado acúmulo de mutações no DNA. Os mutantes foram selecionados com o uso da cerulenina agente interferente ao metabolismo de interesse, de forma que fossem identificados os mutantes cujas alterações genéticas pudessem estar promovendo efeitos sobre este metabolismo. Os mutantes que demonstraram crescimento normal em meio de cultura suplementado com cerulenina foram considerados bons candidatos para estudos aprofundados. Nesta etapa foram selecionados 90 mutantes, dos quais foram selecionados os oito melhores candidatos para estudo através de fermentação em frascos agitados. A avaliação de desempenho fermentativo foi conduzida a partir da avaliação dos índices de crescimento e produtividade de lipídeo utilizando meio de cultura contendo xilose como única fonte de carbono. A fermentação da cepa padrão foi conduzida nas mesmas condições para permitir uma análise comparativa. Os resultados obtidos mostraram que um dos mutantes (identificado como A1) apresentou aumento significativo nos índices de produtividade de biomassa e lipídeo em relação à cepa padrão (teste de Tukey com 95% de significância). Este mutante foi então selecionado para estudo aprofundado através da fermentação em biorreator utilizando a mesma composição de açúcares observada em bagaço de cana-de-açúcar (30% glicose: 70% xilose), conforme determinado em outros estudos conduzidos em nosso laboratório. Novamente, a fermentação da cepa padrão foi conduzida nas mesmas condições para permitir a análise comparativa. Os resultados confirmaram que o mutante A1 apresenta maior produtividade tanto em biomassa (88 g/L) quanto em fração de lipídeo (54,6%), em comparação à cepa padrão (76 g/L e 47,5%, respectivamente). Estes resultados indicam a viabilidade da estratégia de mutagênese aleatória aliadas à seleção de mutantes por cerulenina para o melhoramento genético desta levedura oleaginosa, visando sua aplicação no processo de biossíntese de precursores de biocombustíveis de segunda geração

Abstract: In this work it were performed studies aiming the genetic improvement of the yeast Lipomyces starkeyi strain DSM 70296 for its utilization in the biosynthesis of biofuels' precursors from renewable sources (sugarcane bagasse). Initially, we defined the parameters of mutagenesis. The...

Abstract: In this work it were performed studies aiming the genetic improvement of the yeast Lipomyces starkeyi strain DSM 70296 for its utilization in the biosynthesis of biofuels' precursors from renewable sources (sugarcane bagasse). Initially, we defined the parameters of mutagenesis. The genetic breeding was carried out by random mutagenesis of DNA by ultraviolet irradiation. The exposure time was adjusted to ensure a cell survival rate not exceeding 5%, in order to obtaining individuals presenting high rates of DNA mutations. The mutants were selected by using cerulenin, an compound displaying effects on the metabolism of interest (biosynthesis of lipids). Thus, the selected mutants are potentially carriers of genetic alterations in this particular metabolism. The mutants demonstrating normal growth in culture medium supplemented with cerulenin were considered good candidates for in-depth studies. In this step we selected 90 mutants, of which eight were considered the best candidates for further studies by fermentation in shake flasks. The evaluation of fermentative performance was carried out based on growth and lipid productivity rates using culture medium containing xylose as sole carbon source. The fermentation of the wild-type strain was conducted under the same conditions to allow a comparative analysis. The results showed that the mutant identified as A1 presented a significant increase in the productivity rates of both biomass and lipid in comparison to wild-type strain (Tukey test with 95% significance). This mutant was then selected for detailed study by fermentation in bioreactor using the same carbohydrate composition observed in sugarcane bagasse (30% glucose: 70% xylose), as previously determined by other studies in our laboratory. Again, fermentation of the wild-type and the mutant A1 was performed under the same conditions in order to allow a comparative analysis. The results confirmed that the A1 mutant presents an increased productivity of both biomass (88 g/L) and lipids (54.6%) when compared to the wild-type strain (76 g/L and 47.5%, respectively). These results indicate the feasibility of random mutagenesis strategy coupled with mutant selection employing cerulenin for the genetic improvement of the oleaginous yeast L. starkeyi, focusing its use in the biosynthesis of precursors of second generation biofuels