Orientador: Maria Heloísa de Souza Lima Blotta

Tese (doutorado) - UniversidadeEstadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Pacientes com a forma juvenil da paracoccidioidomicose (PCM) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada por teste de hipersensibilidade do tipo tardio negativo e proliferação linfocitária deficiente a antígenos do fungo e pela produção de citocinas do tipo TH2 como IL-4, IL-5,...

Resumo: Pacientes com a forma juvenil da paracoccidioidomicose (PCM) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada por teste de hipersensibilidade do tipo tardio negativo e proliferação linfocitária deficiente a antígenos do fungo e pela produção de citocinas do tipo TH2 como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-?. Além disso, um aspecto comum desta forma da doença é o número elevado de eosinófilos no sangue periférico, que retorna a valores normais após o tratamento antifúngico. O papel dos eosinófilos na PCM nunca foi investigado. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade funcional de eosinófilos de 15 pacientes com a forma juvenil da PCM. Para tanto eosinófilos isolados do sangue periférico de pacientes (antes e durante o tratamento antifúngico) e de doadores sadios (controles) foram avaliados quanto a: capacidade quimiotática em resposta ao RANTES, eotaxina e IL-5; capacidade de adesão a células endoteliais pulmonares; expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos (CD80, CD86, MHC de classe II, TLR-2 e TLR-4), de moléculas de adesão (CD11a, CD11b, CD49d e CD54), de receptores de IgE (CD23 e FC?RI?), marcadores de ativação (CD69) e do receptor CCR3; atividade fungicida direta contra leveduras de P. brasiliensis e expressão gênica de citocinas, quimiocinas e proteínas de grânulos. Também foi realizada a dosagem dos níveis séricos de constituintes dos grânulos citotóxicos (MBP, EPO, ECP e EDN) e das quimiocinas CCL5, eotaxina, CXCL9, CXCL10 em pacientes antes e durante o tratamento antifúngico e controles. Biópsias de linfonodos e fígados dos pacientes foram analisadas quanto a expressão de RANTES, eotaxina, MBP, IL-25 e IDO. Os resultados mostraram eosinofilia periférica em 86,7% dos casos, altos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis e concentração sérica elevada de proteína C reativa. A resposta quimiotática à eotaxina, a adesão a HLECs e a expressão do RNAm para IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 e CXCL8 foi maior nos eosinófilos de pacientes comparados aos controles. Eosinófilos de pacientes, assim como de controles, foram capazes de matar leveduras de P. brasiliensis. Maior frequência de eosinófilos CD69+ e TLR2+ e menor frequência de eosinófilos CD80+, MHC de classe II+, TLR-4+, CD23+ e CD11a+ foi observada em pacientes comparado aos controles. O acompanhamento dos pacientes durante o tratamento antifúngico mostrou a redução número de eosinófilos do sangue periférico, da concentração sérica de proteína C reativa, dos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis, dos níveis séricos de proteínas citotóxicas e quimiocinas, além de aumento da capacidade migratória em resposta à eotaxina. Adicionalmente, eosinófilos de pacientes apresentam redução da expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos, de ativação, de moléculas de adesão, do receptor de IgE CD23 e do receptor CCR3 durante o tratamento antifúngico. Nas lesões causadas pelo fungo em linfonodos e fígado foi detectada marcação positiva para MBP, eotaxina, RANTES, IL-25 e IDO. Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar que os eosinófilos dos pacientes com a forma juvenil da PCM encontram-se ativados (alta expressão do CD69) e poderiam estar contribuindo para a intensa resposta inflamatória que caracteriza a fase inicial da forma juvenil da PCM e prejudica a resposta de eliminação do fungo. Após o tratamento antifúngico, observou-se uma diminuição dos parâmetros analisados, exceto a capacidade quimiotática dos eosinófilos que aumentou devido, provavelmente, a redução de inibidores da quimiotaxia como o CXCL9 e CXCL10

Abstract: Patients with juvenile form of paracoccidioidomycosis (PCM) have a depressed cellular immune response as shown by negative delayed-type hypersensitivity, suppressed lymphocyte proliferation to P. brasiliensis antigens, and production of TH2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-?....

Abstract: Patients with juvenile form of paracoccidioidomycosis (PCM) have a depressed cellular immune response as shown by negative delayed-type hypersensitivity, suppressed lymphocyte proliferation to P. brasiliensis antigens, and production of TH2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-?. Furthermore, a common feature of this disease is the large number of eosinophils in the peripheral blood that returns to normal values after antifungal treatment. The role of eosinophils in PCM has never been investigated. This study aimed to evaluate the phenotypic and functional characteristics of eosinophils of 15 patients with the juvenile form of PCM. Eosinophils of patients isolated from peripheral blood (before and during the antifungal treatment) and of healthy donors (controls) were evaluated for: chemotactic response to RANTES, eotaxin and IL-5; adhesion to human lung endothelial cells (HLECs); expression of antigen recognition and presentation molecules (CD80, CD86, MHC class II, TLR2 and TLR-4), adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD49d and CD54), IgE receptors (CD23 and FC?RI?), activation marker (CD69) and CCR3; direct fungicidal activity against P. brasiliensis yeast cells and gene expression of cytokines, chemokines and protein granules. We also assessed serum levels of granules cytotoxic molecules (MBP, EPO, ECP and EDN) and chemokines (CCL5, eotaxin, CXCL9, CXCL10) in patients before and during the antifungal treatment and controls. Lymph nodes and liver biopsies of patients were stained for RANTES, eotaxin, MBP, IL-25 and IDO. The results showed peripheral eosinophilia in 86.7% of cases, high titers of antibodies to P. brasiliensis and high concentration of C-Reactive Protein. The chemotactic response to eotaxin, adhesion to HLECs and expression of mRNA for IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 and CXCL8 was higher in eosinophils of patients than in controls. Eosinophils of patients as well as of controls were able to kill P. brasiliensis yeast cells. A higher frequency of eosinophil CD69+ and TLR2+ and lower frequency of eosinophil CD80+, MHC class-II+, TLR-4+, CD23+ and CD11a+ was found in patients compared to controls. Patient's follow-up showed a reduction in the number of eosinophils in peripheral blood, serum concentration of C-Reactive protein, anti-P. brasiliensis antibodies, serum levels of cytotoxic proteins and chemokines, in addition to increased migration capacity. Moreover, eosinophils of patients exhibited reduced expression CD80, MHC class-II, TLR-4, CD23, CD11a, CD11b, CD23, CD69 and CCR3 during the antifungal treatment. Immunohistochemistry staining showed strong expression of MBP, eotaxin, RANTES, IL-25 and IDO in liver and lymph nodes biopsies from PCM patients. In conclusion, this study demonstrated that eosinophils are strongly activated (high CD69 expression) and could contribute to the intense inflammatory response that characterize the initial phase of juvenile form of PCM response and impairs the elimination of the fungus. After antifungal treatment, there was a decrease of all parameters except the chemotactic ability of eosinophils which increased, probably due to reduction of inhibitors of chemotaxis such as CXCL9 and CXCL10