Orientador: Jorg Kobarg

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A proteína UNC-76 foi identificada como necessária para a fasciculação e elongação de axônios do verme Caenorhabditis elegans durante o desenvolvimento do sistema nervoso. A homóloga de mamíferos FEZ1 apresenta altos níveis de expressão em tecidos neuronais e camundongos knockout para o gene...

Resumo: A proteína UNC-76 foi identificada como necessária para a fasciculação e elongação de axônios do verme Caenorhabditis elegans durante o desenvolvimento do sistema nervoso. A homóloga de mamíferos FEZ1 apresenta altos níveis de expressão em tecidos neuronais e camundongos knockout para o gene FEZ1 apresentam desvios de comportamento que remetem a desordens neurológicas. O papel de FEZ1 no desenvolvimento do sistema nervoso parece residir na sua associação com elementos do citoesqueleto e vias de sinalização (e.g., PKC?, E4B, DISC1) que conduzem o crescimento axonal e a polarização celular. Trabalhos do grupo mostram que FEZ1 é uma proteína multifuncional (hub), capaz de interagir com mais de 50 parceiros através de seus domínios coiled-coil. Além disso, a superexpressão de FEZ1 em células HEK293 provoca o aparecimento de núcleos multilobulados, um fenótipo comum em alguns tipos de leucemia. Nesse trabalho foi investigado o papel de FEZ1 nos mecanismos causadores dos núcleos multilobulados e as consequências funcionais de sua superexpressão na viabilidade celular, tentando extrapolar esse modelo para leucemias. Análises in silico de diversas leucemias mostraram que FEZ1 está superexpressa em LMAs e que isso pode se relacionar à ocorrência da fusão 11q23/MLL. A expressão de FEZ1 na linhagem leucêmica THP-1 foi detectada por Western blotting, mas, a expressão em PBMCs de pacientes ainda permanece sem provas empíricas. Para avaliar as consequências funcionais da superexpressão, uma linhagem com expressão estável e indutível foi obtida e utilizada em ensaios de proliferação e resistência a quimioterápicos. Porém, não foram observadas diferenças entre as linhagens expressando a fusão FLAG-FEZ1 e as que expressavam o FLAG tag apenas. Em um ensaio de IP-MS utilizando tais linhagens, foram identificadas proteínas cuja interação com FEZ1 pode ser modulada pela atividade de PKCs. Finalmente, a cotransfecção de FEZ1 inteira com coiled-coils C-terminais diminui a formação de núcleos multilobulados em quase 40%. A transfecção com o mutante FEZ1 nocys contendo 5 cisteínas mutadas não teve o mesmo efeito, mas, novos experimentos são necessários para determinar o potencial de sinergismo que esses dois componentes podem ter sobre a ocorrência desse fenômeno

Abstract: The protein UNC-76 was identified as necessary for fasciculation and elongation of axons of the worm Caenorhabditis elegans during development of the nervous system. The mammalian homologue FEZ1 is mostly expressed in neuronal tissues and FEZ1 knockout mice present behavior abnormalities...

Abstract: The protein UNC-76 was identified as necessary for fasciculation and elongation of axons of the worm Caenorhabditis elegans during development of the nervous system. The mammalian homologue FEZ1 is mostly expressed in neuronal tissues and FEZ1 knockout mice present behavior abnormalities that resemble neurological disorders. The role of FEZ1 in the development of the nervous system seems to lie in its association with cytoskeletal elements and signaling pathways (e.g., PKC?, E4B, DISC1) regulating axon outgrowth and cell polarization. The studies of our group have shown that FEZ1 is a hub, able to interact with more than 50 partners through its coiled-coil domains. Furthermore, overexpression of FEZ1 in HEK293 cells causes the appearance of flower-like nuclei, a common phenotype to certain types of leukemia. In this work the role of FEZ1 in the mechanisms of flower-like nuclei formation and functional consequences of its overexpression on cell viability were investigated, attempting to extrapolate this model for leukemias. In silico analysis of several leukemias showed that FEZ1 is overexpressed in AML patients and that this may relate to the occurrence of 11q23/MLL genetic fusion. FEZ1 expression in leukemic THP-1 cells was detected by Western blotting, but the expression in PBMCs of leukemic patients still lacks empirical evidence. To assess the functional consequences of overexpression, cell lineage with stable and inducible expression of FEZ1 was obtained and used in proliferative assays. However, it was not observed any differences between lineages expressing FLAG-FEZ1 fusion protein or FLAG tag alone. IP-MS assay using these lineages identified proteins whose interaction with FEZ1 could be modulated by the activity of PKCs. Finally, cotransfection of C-terminal coiled-coils and FEZ1 full-length decreases flower-like nuclei formation to nearly 40%. Transfection with FEZ1nocys mutant containing five substituted cysteines did not play the same, but further experiments are needed to determine the potential synergism these two components may have on this phenomenon