Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza

Texto em português e inglês

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Entrega gênica é uma estratégia muito promissora com grande potencial médico, que consiste na introdução de ácidos nucléicos exógenos, e pode ser aplicada tanto para terapia gênica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda é limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja...

Resumo: Entrega gênica é uma estratégia muito promissora com grande potencial médico, que consiste na introdução de ácidos nucléicos exógenos, e pode ser aplicada tanto para terapia gênica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda é limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora muito mais eficientes, os vetores virais ainda despertam preocupações a respeito de sua segurança. Por outro lado, vetores não-virais são muito mais seguros e facilmente manipuláveis, ainda que menos eficientes. Neste contexto, "vírus artificiais" são uma opção interessante, uma vez que são vetores não-virais desenvolvidos para explorar a arquitetura celular de uma forma eficiente, superando uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais, mas mantendo a segurança do DNA plasmidial (pDNA). O principal objetivo da abordagem estudada é explorar os motores moleculares, como dineína, para transportar cargas da periferia para o centrossoma de células de mamíferos através da rede de microtúbulos. Para isso, a cadeia leve Rp3 da dineína foi fusionada a um domínio de interação com DNA (DNA-binding) no N-terminal, e ao peptídeo membrano-ativo TAT no C-terminal. A proteína, nomeada T-Rp3, tem ainda um His-Tag. Esta proteína recombinante construída contém então diferentes domínios para promover condensação do pDNA (DNA binding), para facilitar a entrada na célula e no núcleo (TAT) e para aumentar o escape endossomal (His- Tag), além da própria Rp3 que deve assistir no tráfego intracelular, agindo assim diretamente na maioria dos principais obstáculos intracelulares enfrentados pelos vetores. Estudos de expressão indicam que a proteína recombinante é corretamente expressa em E. coli BL21(DE3). Experimentos de mobilidade em gel de agarose ("gel retardation assay") combinados com estudos de espalhamento de luz e potencial zeta indicam que a proteína efetivamente interage com o pDNA, formando complexos que são pequenos (~95 nm) e positivamente carregados (+28 mV na relação molar de pDNA:proteína 1:8000). Ensaios de transfecção em cultura de células HeLa indicam que T-Rp3 atinge uma eficiência de transfecção muito maior que a proteína nuclear Protamina (aqui usada como controle), chegando a ser 900 vezes maior a expressão relativa do gene repórter na relação molar de pDNA:proteína 1:8000. Na comparação com Lipofectamina 2000TM, um reagente bem caracterizado de transfecção aqui usado como controle positivo, a T-Rp3 demonstrou atingir níveis similares de eficiência, com a vantagem adicional de ser menos citotóxica, conforme evidenciado em ensaios de viabilidade celular. Transfecções realizadas na presença da droga Nocodazol indicam que a eficiência da T-Rp3 depende fortemente da rede de microtúbulos, uma vez que a eficiência é reduzida em 92% quando os microtúbulos estão despolimerizados. A partir das transfecções na presença da droga Cloroquina, pudemos observar que o aprisionamento no endossomo ainda é um fator limitante. Finalmente, ensaios de cromatografia de afinidade realizados com o domínio da cadeia intermediária de dineína imobilizado indicam que a cadeia leve recombinante T-Rp3 mantém a capacidade de interagir com o complexo da dineína. Analisados em conjunto, os resultados apontam para uma grande participação da rede de microtúbulos na eficiência de transfecção de T-Rp3, objetivo inicial deste trabalho

Abstract: Gene delivery is a promising technique with great medical potential that consists in the introduction of exogenous nucleic acids, and can be applied for gene therapy as well as DNA vaccination. However, its use is still limited by the lack of an ideal delivery vector, which is both safe...

Abstract: Gene delivery is a promising technique with great medical potential that consists in the introduction of exogenous nucleic acids, and can be applied for gene therapy as well as DNA vaccination. However, its use is still limited by the lack of an ideal delivery vector, which is both safe and efficient. Although much more effective, viral vectors still raise several concerns about its safety. On the other hand, non-viral vectors are safer and easier to manipulate, but less efficient. In this context "artificial viruses" are an interesting option, since they are non-viral vectors intended to explore the cell's architecture in an efficient way, to overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers, while still preserving the safety of plasmid DNA (pDNA) vectors. The main objective herein is to exploit molecular motors, like dynein, to transport cargoes from the periphery to the centrosome of mammalian cells via the microtubule network. For that, human dynein light chain Rp3 was fusioned to a N-terminal DNA binding domain and a C-terminal membrane active peptide, TAT. The protein, named T-Rp3, has additionally a His.Tag. The shuttle protein built contains therefore different domains to promote pDNA condensation (DNA binding), to increase cell and nucleus penetration (TAT) and to enhance endosomal escape (His.Tag), besides the Rp3 to assist in the cytosol trafficking, thus covering most of the major obstacles to the vectors in intracellular level. Expression studies indicate that the fusion protein was correctly expressed in soluble form using E. coli BL21(DE3) strain. Gel retardation assays, dynamic light scattering and zeta potential studies indicate an efficient complex formation between pDNA and the fusion protein, resulting in a particle that is both small (~95 nm) and potivelly charged (+28 mV in the molar ratio of pDNA:protein 1:8000) Transfection of cultured HeLa cells indicates that T-Rp3 has a much higher transfection efficiency when compared to the nuclear protein Protamine (here used as a control), reaching a 900-fold increase in expression of transfected reporter gene, both in the same molar ratio of pDNA:protein 1:8000. When compared to Lipofectamine 2000TM, a well-known transfection reagent here used as a control, T-Rp3 showed to reach similar levels of efficiency, but with the further advantage of being less cytotoxic, as observed in cell viability assays. Transfections performed in the presence of the drug Nocodazole indicate that T-Rp3 efficiency largely depends on the microtubule network, since its efficiency is reduced by 92% when microtubules are depolymerized. From transfections in the presence of Choroquine we can deduce that endosomal entrapment remains a limiting factor. Finally, affinity chromatography experiments performed with the immobilized domain of dynein intermediate chain demonstrate that the recombinant light chain T-Rp3 retains the ability to interact with the dynein complex. Taken together, these results point to a strong participation of the microtubule network in the enhanced efficiency of T-Rp3