Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através...

Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração

Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in...

Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration