Orientadores: Gonçalves Amarante Guimarães Pereira, Laudiene Evangelista Meyer

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Há no mundo um consenso sobre a necessidade de se encontrar fontes de carbono renováveis para a substituição do petróleo. O cultivo de microalgas tem sido considerado uma alternativa promissora para suprir essas cadeias carbônicas e biocombustíveis, visto que são microorganismos...

Resumo: Há no mundo um consenso sobre a necessidade de se encontrar fontes de carbono renováveis para a substituição do petróleo. O cultivo de microalgas tem sido considerado uma alternativa promissora para suprir essas cadeias carbônicas e biocombustíveis, visto que são microorganismos fotossintetizantes que podem acumular grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) como reserva energética. A transesterificação desses TAG por alcoóis simples gera alquil-esteres, cujas propriedades são muito próximas às encontradas na composição do biodiesel. O glicerol, subproduto da produção de biodiesel, pode ser convertido em propeno, bloco de construção fundamental para a indústria petroquímica. A obtenção de TAG de microalgas requer o cultivo do microorganismo, a recuperação da biomassa do meio líquido e o processamento dessa biomassa para separação da fração lipídica. As etapas de recuperação da biomassa e obtenção da fração lipídica são estágios realmente críticos, de modo que são considerados os principais obstáculos para a viabilidade econômica da produção. A indução artificial da secreção das reservas lipídicas é uma idéia promissora que pode viabilizar a produção de lipídios por microalgas em escala industrial. Em vista disso, o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de bases metodológicas para a construção de um vetor que proporcione comprometimento de das reservas lipídicas com o processo de exocitose. Alguns membros da família SNARE são responsáveis por comprometer vesículas com a via exocítica. Propriedade que pode ser artificialmente introduzida nas reservas lipídicas por meio do domínio SNARE. A busca no genoma de Neochloris oleoabundans, microalga com alto teor lipídico sequenciada por nosso laboratório, indicou 19 sequências pertencentes à família SNARE. A análise dessas sequencias indicou o gene responsável pela via exocítica. A principal forma de reserva energética de microalga são vesículas de TAG chamadas de oilbodies. Em plantas é encontrada a proteína oleosina inserida nesses oilbodies, a cuja existência relaciona-se a um aumento de óleo nas sementes. A oleosina pode ser um bom candidato para carregar o motivo SNARE para as reservas lipídicas dos oilbodies, levando-os a se fusionarem com a membrana plasmática. A necessidade de se confirmar a funcionalidade da oleosina em microalgas levou a construção de um plasmídeo contendo a ORF para oleosina fundida no mesmo quadro de leitura com uma marca visual. A construção foi adaptada para testes em Chlamydomonas reinhardtii, uma miroalga modelo. Uma marca de seleção por antibiótico foi adicionada a fim de se facilitar a busca por tranformantes. Uma vez confirmado o funcionamento da oleosina, uma construção contendo a proteína ligada ao domínio SNARE de exocitose pode ser construída para N. oleoabundans ou qualquer microalga com potencial industrial. Uma tecnologia como essa permitiria a recuperação dos lipídios diretamente do meio de cultura, eliminando etapas críticas para a produção de hidrocarbonetos em larga escala a partir de microalgas e tem potencial de aumentar a taxa de conversão da energia capturada da biomassa em óleo

Abstract: It is worldwide accepted the vital need to find renewable carbon sources to replace the use of petrol. Microalgae can storage triacylglycerol (TAG) as their major energy reservoir. Hence, culturing these photosynthetic microorganisms has been considered a promising alternative for...

Abstract: It is worldwide accepted the vital need to find renewable carbon sources to replace the use of petrol. Microalgae can storage triacylglycerol (TAG) as their major energy reservoir. Hence, culturing these photosynthetic microorganisms has been considered a promising alternative for renewable carbon sources and biofuels production. TAG transestherification produces alquil-esther, which properties are very similar to those found in biodiesel. Furthermore, a byproduct of biodiesel production is glicerol, which can be easily converted to propen, the fundamental block for petro-chemistry industry. Algal TAG production requires the cultivation of the microorganism, followed by dewatering and processing of its biomass in order to obtain the lipid fraction. These last two processes are considered critical and may be regarded as one of the primary obstacles to economic viability of production. Thus, engineered organisms that actively secrete their triacylglycerol content would afford the production of lipids by microalgae in an industrial scale. The aim of this study, therefore, is to establish methodological basis for the development of a molecular device which commits lipid reserves in the exocytosis pathway. Some proteins of SNARE family have the ability to engage their associated vesicles to exocytosis. This property can be artificially introduced into the lipid reserves through the SNARE domain. The triacylglycerol is stored in vesicles called oilbodies, which are the main energy storage in microalgae. Seed plants oilbodies contain imbibed in their membranes proteins called Oleosins, which existence was related to increase in oil reservoir. The anchoring ability of oleosins may be used to carry the SNARE motif to oilbodies, causing them to fuse with the plasma membrane. The genome of Neochloris oleoabundans, a high lipid content microalga, was sequenced by our laboratory. Genome wide analysis revealed 19 SNAREs sequences. The probable SNARE required in the exocytosis pathway and the domains were identified and characterized. Aiming to confirm the functionality of oleosin in microalgae, a plasmid containing an oleosin fused in frame with a GFP reporter was built for Chlamydomonas reinhardtii, a model microalga. An antibiotic resistance marker was added to allow efficient screening of transformed cells. Once the oloeosin function is confirmed in the model, a molecular device comprising the exocytic SNARE domain connected to an oleosin can be built. A device like this can be adapted not only for N. oleoabundans, but also to any microalgae with industrial use potential. Such technology could enable the recovery of TAG lipids directly from the culture medium and would eliminate costly stages of high-scale hydrocarbon production from microalgae. Moreover, it could potentially improve the conversion rate of energy to lipids