Orientador: Fábio Cesar Gozzo

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química

Resumo: Ligação cruzada acoplada à espectrometria de massas (MS) é uma técnica que permite a caracterização estrutural de proteínas e complexos proteicos, especialmente nos casos em que estes não são passíveis de serem analisados por técnicas de alta resolução. O experimento baseia-se na reação de...

Resumo: Ligação cruzada acoplada à espectrometria de massas (MS) é uma técnica que permite a caracterização estrutural de proteínas e complexos proteicos, especialmente nos casos em que estes não são passíveis de serem analisados por técnicas de alta resolução. O experimento baseia-se na reação de uma proteína ou no complexo proteico com um reagente bifuncional (agente de ligação cruzada, ALC) seguido de análise proteômica shotgun por MS. Isso trás para a técnica todas as vantagens da MS, como alta sensibilidade, rapidez de análise e facilidade de uso. Somente resíduos de aminoácidos espacialmente próximos podem ser ligados covalentemente pelo ALC, de forma que os peptídeos contendo a ligação cruzada, identificadas por MS, servem como restrições de distância entre os aminoácidos na estrutura nativa da proteína ou complexo proteico. O conjunto de peptídeos contendo a ligação cruzada fornece, assim, um conjunto de restrições de distâncias entre os aminoácidos que pode ser utilizado para montar um modelo molecular da proteína ou do complexo. O objetivo principal deste trabalho foi a aplicação da técnica de ligação cruzada acoplada a espectrometria de massas no mapeamento da interação entre as proteínas quinase de adesão focal (FAK), através de seu domínio FERM, e miosina. Esse complexo proteico está envolvido na sinalização molecular para o processo de hipertrofia cardíaca. A hipertrofia cardíaca é considerada um mecanismo de adaptação do miocárdio em resposta a sobrecargas hemodinâmicas e está associada com risco de desenvolvimento de insuficiência cardíaca, arritmias e morte súbita. Estímulos mecânicos são considerados os principais ativadores primários das respostas que conduzem às alterações fenotípicas do miocárdio nas várias doenças cardíacas. A caracterização estrutural do complexo FAK/miosina ao nível molecular permitiu a criação de um modelo molecular deste complexo, que foi validado através de mutações na região de interação entre as proteínas. Esse modelo permite que se entenda o processo de sinalização da hipertrofia ao nível molecular

Abstract: Chemical cross-linking coupled with mass spectrometry (MS) is a technique that allows the structural characterization of proteins and protein complexes, especially when these proteins are not amenable to be analyzed by high resolution techniques. The experiment is based on ther eaction of...

Abstract: Chemical cross-linking coupled with mass spectrometry (MS) is a technique that allows the structural characterization of proteins and protein complexes, especially when these proteins are not amenable to be analyzed by high resolution techniques. The experiment is based on ther eaction of a protein or protein complex with a bifunctional reagent (cross-linking agent, ALC) followed by shotgun proteome analysis by MS. This brings to the technique all the advantages of MS, such as high sensitivity, short analysis time and ease of use. Only spatially close amino acid residues can be covalently bound by the reagent, so that the cross-linked peptides, identified by MS, serve as distance constraints between amino acids in the native structure of the protein or protein complex. The set of cross-linked peptides thus provides a set distance constraints among amino acids that can be used to build a molecular model of the protein or complex. The main objective of this work was to apply the cross-linking technique coupled to MS to map the interaction between the proteins Focal Adhesion Kinase (FAK), through its FERM domain, and myosin. This protein complex is involved in molecular signaling of the cardiac hypertrophy process. Cardiac hypertrophy is considered an adaptative mechanism of the myocardium in response to hemodynamic overload and it is associated with risk of developing heart failure, arrhythmias and sudden death. Mechamical stimuli are considered the main activator of the primary responses that lead to phenotypic changes of the myocardium in many cardiac diseases. The structural characterization of the complex FAK/myosin at the molecular level has allowed the creation of a molecular model of this complex, which was validated by mutations in the region of interaction between the proteins. This model allows the understanding the signaling processes of hypertrophy at the molecular level