Orientação: Wanderley Dias da Silveira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Amostras de Escherichia coli portadoras das fímbrias FY e 31A, associadas a diarréia e septicemia em bovinos, foram estudadas visando determinar a localização da expressão gênica destas fímbrias. As amostras bacterianas 31A+: BZ43, BZ2468 e 31A e FY+: Att25, 54-5, 2147-4 e 11a, foram...

Resumo: Amostras de Escherichia coli portadoras das fímbrias FY e 31A, associadas a diarréia e septicemia em bovinos, foram estudadas visando determinar a localização da expressão gênica destas fímbrias. As amostras bacterianas 31A+: BZ43, BZ2468 e 31A e FY+: Att25, 54-5, 2147-4 e 11a, foram analisadas quanto à produção de enterotoxinas (STI e LT), VT, hemolisina, resistência a antibióticos, hemaglutinação D-manose resistente com eritrócitos e reação com antissoros específicos. A caracterização das fímbrias envolveu microscopia eletrônica, análise eletroforética de proteínas totais, de superfície e de membrana em SDS-PAGE e "Western Blotting". Foi também verificada a presença de plasmídios conjugativos nas amostras bacterianas e a caracterização dos transconjugantes para a expressão de FY e 31A. Uma amostra portadora de fímbria 31A (amostra BZ43) foi mutagenizada com transposon TnphoA. A expressão de 31A foi avaliada através de aglutinação com antissoros específicos, hemaglutinação de eritrócitos de boi, adesão a células Hela em cultura de tecido e patogenicidade em teste de competição em camundongo. A análise dos padrões de hemaglutinação, proteínas totais, proteínas de superfície e aglutinação com antissoros específicos permitiu a determinação das subunidades protéicas destas fímbrias como sendo aproximadamente 20 kDa para FY e 17 kDa para 31A. A amostra 11a, anteriormente classificada como portadora de fímbria FY, foi reclassificada como portadora de fímbria 31A através dos resultados de SDS-PAGE de proteínas de superfície e reação com antissoros específicos. As amostras Att25, BZ2468 e 31A apresentaram plasmídios conjugativos com marcas de resistência a antibióticos, porém não codificaram para a expressão de fímbrias nas linhagens transconjugantes, sugerindo que a expressão destas fímbrias ocorre a nível cromossômico. A amostra BZ43 mutagenizada com TnphoA originou duas amostras não-hemaglutinantes (eritrócitos bovinos) que apresentaram reação com o anticorpo específico anti-31A. A perda da capacidade de hemaglutinação foi relacionada à ausência da subunidade da fímbria 31A (17 kDa) em SDS-PAGE de proteínas de superfície. Uma das amostras mutantes apresentou fímbrias em microscopia eletrônica. A ausência defímbrias no outro mutante foi relacionada à não expressão de uma proteína de membrana de 35 kDa. A perda da capacidade de eritrócitos de bovino, associada ou não aglutinação de à expressão de fímbrias, não alterou o padrão de adesão a células HeLa dos mutantes (AD). A amostra BZ43 e o mutante fimbriado não apresentaram patogenicidade no teste de competição em camundongos de 3 dias de idade. A perda da capacidade de hemaglutinação parece não conferir uma menor adesão da amostra mutante nestes animais

Abstract: Escherichia coli strains associated with diarrhea and septicemic infections of cattle were studied to determine the genetic expression of FY and 31A fimbriae. The strains 31A+: BZ43, BZ2468 and 31A, and FY+: Att25, 54-5, 2147-4 and 11a, were evaluated for enterotoxin production (STI and...

Abstract: Escherichia coli strains associated with diarrhea and septicemic infections of cattle were studied to determine the genetic expression of FY and 31A fimbriae. The strains 31A+: BZ43, BZ2468 and 31A, and FY+: Att25, 54-5, 2147-4 and 11a, were evaluated for enterotoxin production (STI and LT), VT, hemolysin, antibiotic resistance, mannose resistant RBC hemagglutination, and reaction with specific antisera. The characterization of fimbriae involved electron microscopy, SDS-PAGE of total, surface and membrane proteins and Western blotting. Conjugative plasmids in the strains were transferred and analyzed for FY and 31A expression. Hemagglutination, SDS-PAGE of total and surface proteins and reaction with specific antisera allowed the location of the fimbrial subunits at 20 kDa for FY and 17 kDa for 31A. Strain 11a, originally grouped as FY by others, was classified as 31A based on SDS-PAGE of surface proteins and reaction with specific antisera. Strains Att25, BZ2468 and
31A had conjugative plasmids coding antibiotic resistance marks, but transconjugants failed to express the fimbriae, suggesting it could be located in the bacterial chromosome. Strain BZ43 (31A) was mutagenized using TnphoA transposon and mutants with negative hemagglutination of bovine RBC were assayed with specific antiserum, and tested for adhesion to HeLa cells in tissue culture and pathogenicity in the mouse competition assay. Loss of hemagglutinating capacity was related to the lack of the 31A fimbriae subunit (17 kDa) on SDS-PAGE of surface proteins. One mutant strain showed fimbriae under electron microscopy. The absence of fimbriae in the other mutant strain was related to a missing 35 kDa membrane protein. Both mutants reacted positively with absorbed anti-31A antiserum suggesting that fímbrial epithopes were expressed. Loss of bovine RBC hemagglutination did not altered the adhesion patter to HeLa cells (AD), either in the fimbriated or in the non-fimbriated mutant strain. Strain BZ43 and the fimbriated mutant strain were non-pathogenic to 3 day old mice in the competition assay. The lack of hemagglutination seemed not to interfere with adhesion properties of the mutant strain in this assay