Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Carolina Louzão Bigarella

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A medula óssea é constituída por microambientes específicos denominados "nichos". O fator SDF-1 (Stromal derived factor-1) foi identificado como um importante fator quimioatrativo produzido por células estromais da medula óssea. Sua ação sobre seu receptor CXCR4 desempenha função primordial...

Resumo: A medula óssea é constituída por microambientes específicos denominados "nichos". O fator SDF-1 (Stromal derived factor-1) foi identificado como um importante fator quimioatrativo produzido por células estromais da medula óssea. Sua ação sobre seu receptor CXCR4 desempenha função primordial na migração, retenção e desenvolvimento dos progenitores hematopoiéticos na medula óssea. Células leucêmicas mielóides e linfóides expressam CXCR4 e aproveitam-se disso para acessar nichos medulares normalmente restritos ás células progenitoras, passando a residir em microambientes que propiciam sobrevivência e proliferação. Recentemente foi descoberto que o receptor CXCR7 é capaz de se ligar ao SDF-1. Ele é expresso em várias linhagens tumorais, mas em células hematopoiéticas seu papel é ainda pouco explorado. Em vista da escassez de dados na literatura o objetivo deste trabalho foi investigar a expressão e função de CXCR7 em síndromes mielodisplásicas e leucemias agudas. Neste estudo, foi mostrado que a expressão gênica de CXCR7 foi significativamente maior em leucemia linfoblástica aguda (LLA) em comparação com sindrome mielodisplásica (SMD), leucemia mielóide aguda (LMA) e indivíduos controles (p<0.0001, Mann-Whitney). A proteína CXCR7 também foi mais expressa em linhagens celulares linfoblástica T (Molt-4 e Jurkat) em comparação com linhagens mielóides. Em células linfoblásticas T, a localização subcelular de CXCR7 e CXCR4 por microscopia confocal e citometria de fluxo evidenciou CXCR7 mais próximo à membrana das células Molt-4 e mais frequentemente no citoplasma de células Jurkat enquanto CXCR4 está na membrana de ambas as linhas celulares. Curiosamente, notamos também que, depois da indução de SDF-1, células Molt-4 têm maior capacidade migratória comparada com Jurkat (mediana Molt 4 = 52,0 ± 5 vs Jurkat = 24,1 ± 3, p = 0,0079, teste de Mann-Whitney), que pode estar relacionado com a disponibilidade de membrana de CXCR7. Além disso, a inibição da CXCR7 ou CXCR4 resultou em mudanças significativas na resposta migratória de Molt4 e Jurkat (p<0,05 Mann-Whitney), no entanto, a inibição de ambos, CXCR7 e CXCR4 resultou em uma redução mais significativa na migração celular (p = 0.0079/Molt-4; p = 0.0043/Jurkat, Mann-Whitney). Uma vez que é bem estabelecido que células CD34+ de pacientes com SMD não são atraídas pelo gradiente de SDF-1, apesar de terem expressão normal de CXCR4, nos interessou investigar qual a localização de CXCR4 nas células SMD e se esta irresponsividade estava associada a CXCR7. Linhagens mielóides P39 e U937 foram usadas como modelo de SMD e LMA, respectivamente. Foram encontrados níveis similares de expressão de CXCR4 e CXCR7 em ambas as linhagens celulares, no entanto encontramos que CXCR4 está localizado no citoplasma de células P39 enquanto ele está na membrana das células U937. Uma vez que a proteína quinase C isotipo zeta (PKC'dzeta' está relacionada com a sinalização SDF-1/CXCR4 aumentando a expressão de CXCR4 e sua disponibilidade na membrana, resolvemos trabalhar também com células P39 hiperexpressando PKC'dzeta' (PKC'dzeta'wt). Este procedimento resultou na translocação de CXCR4 para a membrana de células P39, mas não alterou a localização subcelular de CXCR7. Ensaios de migração por tranwell mostraram que células P39 PKC'dzeta'wt apresentam maior capacidade de migração em relação a SDF-1 em comparação com células P39 controle (aumento de 35 vezes pcDNA3 PKC-'dzeta'-HA vs pcDNA3 transfectadas células P39, p = 0,0032, Mann-Whitney), sugerindo que a PKC'dzeta' restaura a capacidade quimiotática de células P39. Aumento da expressão de CXCR7, como aqui observado em células leucemicas linfoblásticas, é um fenômeno já descrito em uma variedade de linhagens de células tumorais sólidas, tais como cérebro, próstata e pulmão. Em tumores sólidos, CXCR7 principalmente aumenta a proliferação de células malignas. Estes resultados sugerem que a função biológica de CXCR7 depende tecido e órgãos que ele está localizado e que, na leucemia linfoblástica aguda pode ter um papel na migração de células, potencializando a resposta de CXCR4 a SDF-1 e, portanto, poderia contribuir para o recrutamente de células leucêmicas para nichos uma vez já ocupados por células-tronco hematopoéticas normais. Além disso, nossos resultados levam a crer que um defeito na via PKC'dzeta'/CXCR4 está envolvido com a irresponsividade de células SMD a SDF-1, gerando uma hematopoese ineficaz. E confirma dados que sugerem que PKC'dzeta' é uma proteína central na via de sinalização SDF-1/CXCR4, muito importante para a migração de células hematopoéticas malignas

Abstract: Bone marrow is constituted of specific microenvironments called "niches". The factor SDF-1 (stromal derived factor-1) was identified as an important chemoattractant factor produced by bone marrow cells. SDF-1 acts on its receptor CXCR4 and plays primordial function in migration, retention...

Abstract: Bone marrow is constituted of specific microenvironments called "niches". The factor SDF-1 (stromal derived factor-1) was identified as an important chemoattractant factor produced by bone marrow cells. SDF-1 acts on its receptor CXCR4 and plays primordial function in migration, retention and development of hematopoietic progenitors in bone marrow. CXCR4 is expressed in leukemic cells and enables them to access marrow niches that normally are restricted to quiescent stem cells, thereby ensuring its protection from cell death resulting in a worse prognosis. Recently, CXCR7 was identified as another SDF-1-binding receptor, but its contribution to SDF-1 - mediated effects in hematopoietic cells is still poorly explored, even though the CXCR7 relationship with tumor progression in non-hematopoietic malignancies is well established. Given that there is little information regarding CXCR7 we investigated its function and expression in MDS and acute leukemias. This work, was showed that CXCR7 is significantly higher expressed in ALL compared to MDS, AML and control subjects (p<0.0001, Mann-Whitney test). CXCR7 protein is also higher expressed in lymphoblastic cell lines (Molt-4 and Jurkat) compared with myeloid cells. In lymphoblastic cell lines, the subcellular location of CXCR7 and CXCR4 by confocal microscopy and flow cytometry evidenced CXCR7 closer in the membrane of Molt-4 cells and more frequently in the cytoplasm of Jurkat cells whereas CXCR4 was in the membrane of both cell lines. Interestingly, we also noticed that, after SDF-1 induction, Molt-4 cells have higher chemotactic ability compared with Jurkat (median Molt 4=52.0 ± 5 vs Jurkat=24.1 ± 3, p=0.0079, Mann-Whitney test) which may be related with the membrane availability of CXCR7. In addition, the inhibition of CXCR7 or CXCR4 resulted in significant changes in Molt4 and Jurkat chemotactic response (p<0,05, Mann-Whitney test), however, the inhibition of both CXCR7 and CXCR4 resulted in a more significant reduction in cell migration (p=0.0079/Molt-4; p=0.0043/Jurkat, Mann-Whitney test). Since it is well established that CD34 + progenitor cells from patients with myelodysplastic syndromes (MDS) are not attracted by gradient of SDF-1 despite of having CXCR4 normal expression, we addressed if MDS cells have an abnormal localization of CXCR4 or association with CXCR7. P39 and U937 cell line were used as a model of MDS and AML, respectively. Similar expression levels of CXCR4 and CXCR7 in both cell lines however we found, by confocal microscopy and flow cytometry, that CXCR4 was localized in the cytoplasm of P39 cells while it was in the membrane of U937 cells. Since the protein quinase C (PKC'dzeta') is related to the SDF-1/CXCR4 signaling by increasing CXCR4 expression and its membrane availability, we decided to work with cells P39 overexpressing PKC'dzeta' (PKC'dzeta'wt). This procedure resulted in translocation of CXCR4 to the membrane of P39 cells but did not change the CXCR7 subcellular localization. Transwell chemotaxis assay showed that P39 cells overexpressing PKC'dzeta' displayed higher chemotactic ability upon SDF-1 treatment compared with control P39 (35 fold increase pcDNA3-PKC'dzeta'-HA vs pcDNA3-HA transfected P39 cells, p=0.0032; Mann-Whitney), suggesting that PKC'dzeta' restored the chemotactic capacity of P39 cells. Increased expression of CXCR7, as here observed in lymphoblastic leukemia cells, is a phenomenon already described in a variety of solid tumor cell lines such as brain, prostate and lung. In solid tumors, CXCR7 mainly increases the proliferation of malignant cells. These results suggest that the biological function of CXCR7 depends on its tissue and organ localization and that, in acute lymphoblastic leukemia may have a role in cell chemotaxis, potentiating CXCR4 response to SDF-1 and thus, could contribute for leukemia initiating cell recruitment to niches once occupied by normal hematopoietic stem cells. Furthermore, our results lead us to believe that a defect in the PKC'dzeta'/CXCR4 pathway is involved with the unresponsiveness of MDS cells to SDF-1, generating an ineffective hematopoiesis. It confirms data that suggest that PKC'dzeta' is a central protein in the SDF-1/CXCR4 signaling pathway, important for the migration of malignant hematoietic cells