Orientador: Flavia Maria Netto

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: Existem evidências numerosas sobre o papel dos radicais livres em uma série de condições patológicas, incluindo envelhecimento, câncer, esclerose múltipla, doenças cardiovasculares. Hidrolisados protéicos de diferentes fontes têm sido estudados por seu potencial antioxidante. A atuação...

Resumo: Existem evidências numerosas sobre o papel dos radicais livres em uma série de condições patológicas, incluindo envelhecimento, câncer, esclerose múltipla, doenças cardiovasculares. Hidrolisados protéicos de diferentes fontes têm sido estudados por seu potencial antioxidante. A atuação antioxidante da proteína, na maioria das vezes, encontra-se limitada devido à conformação espacial, que concentra resíduos capazes de neutralizar radicais livres no interior da molécula, dificultando o acesso das espécies reativas aos centros nucleofílicos. A hidrólise da proteína contribui para aumentar a exposição desses resíduos de aminoácidos, aumentando sua atuação como antioxidante. Compostos fenólicos podem estar presentes em hidrolisados proteicos de origem vegetal, devido a sua associação com as proteínas. Métodos in vitro que simulam as condições do trato gastrointestinal permitem estudar como a digestão pode interferir na atividade antioxidante de peptídeos e compostos fenólicos. O presente trabalho tem como objetivos obter hidrolisados proteicos com capacidade antioxidante a partir da farinha de linhaça e avaliar o efeito da digestão in vitro pode interferir nessa atividade. A farinha de linhaça marrom foi desengordurada, obtendo-se a farinha de linhaça marrom desengordurada (FLMD). O concentrado proteico de linhaça (CPL) foi obtido a partir da FLMD por extração alcalina e precipitação no ponto isoelétrico seguida de neutralização. Para obtenção dos hidrolisados proteicos (HPL), a partir do CPL, com Alcalase, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 2². As variáveis independentes foram pH que variou entre 7,5 a 9,5 e relação enzima: substrato (E:S) que variou de 1:150 a 1:30. As variáveis dependentes foram grau de hidrólise (GH), teor de substâncias redutoras do reagente de Folin-Ciocalteau e atividade antioxidante, determinada por FRAP e ORAC. Teor de substâncias redutoras e atividade antioxidante foram avaliados a partir dos extratos aquosos e metanólico (metanol 70%). Os hidrolisados de maior atividade antioxidante, a FLMD e o CPL foram submetidos à digestão in vitro, simulando as condições da digestão gastrintestinal. As amostras antes e após a digestão in vitro foram caracterizadas por eletroforese em sistema SDS-PAGE Tricina e por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC- RP). O teor de substâncias redutoras e da atividade antioxidante das amostras FLMD, CPL e HPL foram avaliados antes e após a digestão in vitro. As condições ótimas para obtenção de HPL de maior GH (21,0%) são pH entre 7,5 e 8,0 e E:S entre 1:60 e 1:30, indicando que a faixa de pH ótimo da enzima e a alta E:S favorecem maior hidrólise do CPL. Para obtenção de HPL com maior teor de substâncias redutoras para os extratos aquoso (24 mg EAG/ g HPL) e metanólico (20 mg EAG/ g HPL) as condições ótimas são pH ~ 8,5 /E:S 1:30. Este resultado parece estar relacionado à liberação de compostos fenólicos ligados a proteína e também de peptídeos durante a hidrólise. Açúcares e aminoácidos aromáticos presentes no hidrolisado podem interferir na reação e superestimar o teor de fenóis dos HPL. A maior atividade antioxidante determinada pelo método de FRAP para o extrato aquoso (42 mg SF/ g HPL) se dá nas condições de pH ~ 9,5/E:S ~1:150 e para o extrato metanólico (40 mg SF/ g HPL) pH entre 8,5 e 9,0/E:S entre 1:90 a 1:150. Para o método de ORAC, as condições ótimas para maior atividade antioxidante no extrato aquoso (300 µmol TE/ g HPL) são pH entre 7,5 a 9,5/E:S ~ 1:30 ou ~1:150 e para o extrato metanólico (330 µmol TE/ g HPL) são pH ~ 8,5/E:S entre 1:150 e 1:30. Os hidrolisados de maior atividade antioxidante foram os obtidos em pH 8,5/E:S 1:90, e em pH 9,2/E:S 1:133 denominados HPL 0 e HPL 3, respectivamente. Para a FLMD, CPL e os hidrolisados, após a digestão in vitro, observou-se que o teor de substâncias redutoras totais aumentou (9 a 20 vezes) para todas as amostras. O teor de substâncias redutoras do CPL (~24 mg EAG/ g amostra), em ambos os extratos, após a digestão in vitro se igualou ao teor dos hidrolisados (~23 mg EAG/ g amostra). Este resultado sugere que tanto a hidrólise com Alcalase quanto o processo digestório liberam compostos redutores, dentre eles fenólicos da proteína de linhaça. A atividade antioxidante dos extratos de FLMD e CPL, determinada por FRAP, também aumentou (de 3 a 10 vezes) após a digestão, mas não se igualou à atividade antioxidante dos hidrolisados (48 mg SF/g amostra). No entanto, o CPL apresentou atividade antioxidante determinada por ORAC semelhante à dos hidrolisados no extrato aquoso (~420,24 µmol TE/ g amostra) e 10 % maior que o encontrado para os hidrolisados (~365 µmol TE/ g amostra) no extrato metanólico. Após a digestão in vitro, os hidrolisados apresentaram a maior atividade antioxidante medida por FRAP (50 mg SF/ g amostra), e o CPL, a maior atividade determinada pelo método de ORAC (~430 µmol TE/ g amostra). Estes resultados sugerem o processo digestório é tão ou mais eficiente que a Alcalase em liberar os compostos com atividade redutora no CPL. Uma vez que a metodologia de determinação da atividade antioxidante por ORAC tem maior proximidade com o mecanismo de oxirredução que ocorre in vivo, esses resultados sugerem o uso do CPL como melhor produto protéico da linhaça com maior potencial antioxidante para a formulação de nutracêuticos e alimentos funcionais

Abstract: There are several evidences which indicate the role of free radicals on a series of pathological conditions, including aging, cancer, multiple sclerosis and cardiovascular disease. Hydrolysates from different sources have been studied because of their antioxidant potential. The antioxidant...

Abstract: There are several evidences which indicate the role of free radicals on a series of pathological conditions, including aging, cancer, multiple sclerosis and cardiovascular disease. Hydrolysates from different sources have been studied because of their antioxidant potential. The antioxidant activity of the protein, in most cases, is limited due to their conformation, which concentrates residues capable of neutralize free radicals in the molecule¿s core, hampering the access of the reactive species to nucleophilic sites. The protein hydrolysis contributes to increasing the exposure of these amino acid residues, increasing their role as antioxidants. Phenolic compounds may also be present in vegetable protein hydrolysates because of their association with proteins. In vitro methods that simulate the conditions of the gastrointestinal digestion are an important way to evaluate how the digestion affects the antioxidant activity of phenolic compounds and peptides. This study aims at obtaining hydrolysates with antioxidant capacity from defatted flaxseed flour and evaluate the effect of the in vitro digestion on this activity. The brown flaxseed flour was defatted, resulting in the brown defatted flaxseed meal (BDFM). The flaxseed protein concentrate (FPC) was obtained from the BDFM by alkaline extraction and precipitation at the isoelectric point followed by neutralization. To obtain the flaxseed protein hydrolysates (FPL), using FPC and Alcalase, a central composite rotational design (DCCR) was performed. The independent variables were pH ranging from 7.5 to 9.5 and enzyme: substrate ratio (E: S) that ranged from 1:150 to 1:30. The dependent variables were the degree of hydrolysis (DH), total phenolic content and antioxidant activity, determined by FRAP and ORAC. Phenolic and antioxidant activity were evaluated from the aqueous and methanol (70% methanol). The hydrolysates with the highest antioxidant activity, the CPL FLMD were submitted to the in vitro digestion. The samples obtained before and after the in vitro digestion were characterized by electrophoresis SDS-PAGE- tricine and HPLC. The total phenolic content and antioxidant activity of FLMD, CPL and HPL were evaluated before and after in vitro digestion. The optimum conditions to obtain HPL with the highest GDH (21.0%) are pH (7.5-8) and E:S ratio (1:60-1:30), which indicates that the Alcalase optimum pH and highest E:S ratio collaborates to highest hydrolysis of CPL. To obtain HPL with higher content of Folin-Ciocalteau reducing compounds content in aqueous (EAG 24 mg / g HPL) and methanol (20 mg EAG / g HPL) extracts, the optimum conditions were pH ~ 8.5 / E: S 1:30. This result seems to be related to the release of phenolic compounds bound to protein and also of peptides during hydrolysis. The highest antioxidant activity determined by the FRAP method in the aqueous extract (42 mg SF / g HPL) occurs under pH ~ 9.5 / E: S ~ 1:150 and the methanol extract (40 mg SF / g HPL) pH 8.5-9.0 / E: S 1:90-1:150. For the ORAC method, optimum conditions for increased antioxidant activity in aqueous extract (300 µmol TE / g HPL) are pH 7.5-9.5 / E: S ~ 1:30 or 1:150 and the methanol extract (330 µmol TE / g HPL) are pH ~ 8.5 / E: S 1:30-1:150. The hydrolysates with the highest antioxidant activities were obtained at pH 8.5 / E: S 1:90, and at pH 9.2 / E: S 1:133 denominated HPL ) and HPL 3, respectively. For FLMD, CPL and hydrolysates, after in vitro digestion, the content increased (9-20 times) for all samples. The Folin-Ciocalteau reducing capacity of the CPL (EAG ~ 24 mg / g sample) in both extracts after in vitro digestion equaled the content of hydrolysates (EAG ~ 23 mg / g sample). This result suggests that both hydrolysis with Alcalase and the digestion process are able to release phenolic compounds from the flaxseed products. The antioxidant activity of extracts of FLMD, CPL determined by FRAP, also increased (from 3 to 10 times) after digestion, but did not reached the antioxidant activity of hydrolysates (48 mg SF / g sample). However, when the activity was determined by ORAC, the FPC showed value similar to the hydrolysates, measured on the aqueous extract (~ 420.24 µmol TE / g sample) and 10% higher than on the methanol extract (~ 365 µmol TE / g sample). After in vitro digestion, hydrolysates showed the highest antioxidant activity measured by FRAP (SF 50 mg / g sample), and the FPC, the highest activity determined by ORAC method (~ 430 micromol TE / g sample). These results suggest that digestive process are equally or more effective than Alcalase in releasing peptides and phenolic compounds present in the FPC. Since the methodology for determining the antioxidant activity by ORAC utilizes a biologically relevant radical source, these results suggest the use of FPC as the best protein product of flaxseed with potential antioxidant in the formulation of nutraceuticals and functional foods