Orientador: Fernando Ferreira Costa, Anderson Ferreira da Cunha

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Durante o desenvolvimento ontogenético, ocorrem alterações na expressão dos genes das globinas, caracterizando o switching de hemoglobina. Após o nascimento há o silenciamento do gene da globina ? concomitante à ativação do gene da globina ?. Todavia, algumas deleções gênicas no grupamento...

Resumo: Durante o desenvolvimento ontogenético, ocorrem alterações na expressão dos genes das globinas, caracterizando o switching de hemoglobina. Após o nascimento há o silenciamento do gene da globina ? concomitante à ativação do gene da globina ?. Todavia, algumas deleções gênicas no grupamento dos genes das globinas e algumas mutações de ponto no promotor do gene da globina ? são responsáveis pela expressão continuada do gene da globina , resultando em níveis elevados de hemoglobina fetal (HbF) na vida adulta, caracterizando, respectivamente, a Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal delecional e a não delecional (ndPHHF). A mutação de ponto C?G na posição -195 do promotor do gene da globina ?A caracteriza a ndPHHF tipo Brasileira (ndPHHF-B), com aumento nos níveis de HbF entre 6% e 16%. Todavia, o mecanismo molecular responsável pela reativação do gene da globina ?A na ndPHHF-B não está elucidado. Estudos anteriores demonstraram que na ndPHHF tipo Brasileira (-195) a elevação nos níveis de HbF não é mediada pelo aumento na afinidade com o fator de transcrição SP1, como ocorre na ndPHHF-B tipo Inglesa (-198). Na tentativa de compreender o mecanismo responsável pelo fenótipo de ndPHHF-B, buscamos identificar outros fatores de transcrição envolvidos na reativação do gene da globina ?A nessa ndPHHF-B. Os resultados obtidos através de ensaios de Array DNA-proteína, EMSA e ChIP mostraram uma alteração na interação de dois fatores de transcrição: NF-E1/YY1 e PAX1. A mutação -195 C?G abole o sítio de ligação para o NF-E1/YY1 e aumenta a interação do PAX1, um ativador da transcrição, com o promotor do gene da globina ?A , possivelmente levando à reativação desse gene. Também investigamos o possível envolvimento de outros genes que poderiam estar relacionados à manutenção dos níveis elevados de HbF, construindo Bibliotecas Subtrativas Supressivas para identificar transcritos diferencialmente expressos em reticulócitos de portadores de ndPHHF-B. Os resultados apontam para uma possível participação do gene MIER1 no switching da hemoglobina fetal para a adulta, uma vez que esse gene, responsável pelo remodelamento de cromatina e consequente silenciamento gênico, apresentou expressão diminuída em portadores de ndPHHF-B. Identificamos ainda outro gene, o KLF1, com expressão diminuída nesses indivíduos, o que pode favorecer a interação entre o gene da globina ?A e o LCR. Nossos resultados fornecem a primeira evidência in vitro do provável mecanismo molecular envolvido na reativação do gene da globina ?A na ndPHHF tipo Brasileira

Abstract: Hemoglobin switching occurs after birth resulting in a decrease in gamma globin gene expression. Although, some single point mutation in this gene are able to maintain its expression during adult life, leading to increased production of fetal hemoglobin (HbF) which characterize the non...

Abstract: Hemoglobin switching occurs after birth resulting in a decrease in gamma globin gene expression. Although, some single point mutation in this gene are able to maintain its expression during adult life, leading to increased production of fetal hemoglobin (HbF) which characterize the non deletion Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (ndHPFH). Among these, the Brazilian type of ndHPFH corresponds to the C?G substitution at the -195 position of the A gamma globin gene. However, the molecular mechanism responsible for this phenotype still unclear. In contrast to the British ndHPFH type (-198), where the mechanism responsible for the increase of HbF levels is mediated by the raising in the affinity for the SP1 transcription factor, the Brazilian ndHPFH mutation does not affect Sp1 binding. In order to elucidate this mechanism, we tried to identify others transcription factors involved in the reactivation of the A gamma globin gene in the Brazilian ndHPFH. Alterations in the binding of two transcription factors were identified by DNA-protein Array, EMSA and ChIP: NF-E1/YY1 and PAX-1. Our results suggest that the -195C?G in the A gamma globin promoter may abrogate NF-E1/YY1 binding and increase PAX-1 binding in this DNA region, probably resulting in the reactivation of this gene. We also investigate others genes that may be involved in hemoglobin switching and/or maintenance of elevated HbF levels in Brazilian ndHPHF using Suppression Subtractive Hybridization Library to identify transcripts that are differentially expressed in reticulocytes of ndHPFH Brazilian subjects. MIER1 expression was found to be decreased in Brazilian ndHPFH reticulocytes, compared to controls. The MIER1 gene is able to chromatin-remodeling leading to the formation of heterochromatin and, consequently, silencing genes. This MIER1 may be an important gene in gamma to beta globin gene switching, where it could help in the maintenance of a closed chromatin structure in the gamma globin gene in individuals with low HbF levels. Another gene identified was KLF1 which expression was decreased in Brazilian HPFH and favors the interaction between the A gamma globin gene and the LCR. These results provide the first in vitro evidence for the possibly molecular mechanism of reactivation of the A gamma globin gene in Brazilian nHPFH.