Orientador: Maria Lucia Furlan Wada

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O colágeno é amplamente utilizado como substrato para adesão e proliferação de células in vitro. Os substratos à base de colágeno podem ser preparados de formas variadas, podendo-se obter filmes secos de colágeno, gel flutuante ou estruturas tridimensionais. Diversos tipos celulares, quando...

Resumo: O colágeno é amplamente utilizado como substrato para adesão e proliferação de células in vitro. Os substratos à base de colágeno podem ser preparados de formas variadas, podendo-se obter filmes secos de colágeno, gel flutuante ou estruturas tridimensionais. Diversos tipos celulares, quando cultivados em diferentes substratos de colágeno apresentam variações em suas características morfofisiológicas. Assim, não somente a presença de elementos da matriz extracelular mas também sua organização molecular são importantes para que as células expressem seu genótipo.Outro aspecto relevante sobre o comportamento das células durante a cultura é o fato de contraírem o gel de colágeno, tal como ocorre na derme em processos de cicatrização, fibroses e desenvolvimento do tecido conjuntivo. Em nosso trabalho, tivemos por objetivo estudar o padrão de crescimento e alterações morfofisiológicas de células VelO cultivadas sobre gel de colágeno tipo I. Amostras com 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias de cultivo foram fixadas em Kamovsky e incluídas em Paraplast. Cortes de 5f.U1l foram submetidos às colorações de Hematoxilina­eosina (HE), Azul de toluidina pH 4,0 (AT), Xilidine Ponceau (XP) e PAS. Num outro experimento, foram colhidas amostras com 1, 2, 3, 4 e 5 dias de cultura na ausência e presença de soro fetal bovino, tendo-se medido o diâmetro da face superior do gel, para quantificação da contração. Com 1 dia de cultivo, as células aderiram a superfície do gel e formaram uma monocamada, com morfologia inicialmente arredondada e posteriormente fibroblastóide, apresentando coloração nuclear intensa ecitoplasma meta cromático com AT, núcleo e citoplasma corados com XP e citoplasma corado com P AS. Após 5 dias de cultivo várias camadas de células fibroblastóides são observadas na superfície do gel. Alguns focos de infiltração são observados assim como numerosos grânulos meta cromáticos que são depositados no interior do gel. Estes grânulos também se coravam pelo XP e P AS. Nos tempos posteriores de incubação, a proliferação e infiltração para o interior do gel são mais proeminentes e o padrão de coloração pelos AT, XP e P AS foram mantidos. Aos 20 dias de cultivo o gel assemelha-se a um tecido conjuntivo frouxo, representado por uma grande população de células dispersas numa matriz tridimensioanal finamente fibrilar. Aos 25 dias de cultivo observou-se um aumento do pregueamento da superfície do gel e uma reorganização das fibras do gel de colágeno evidenciadas por XP, caracterizando o processo de contração causado pelas células Vero neste substrato. Neste tempo de cultivo, as células da superfície se apresentam com o mesmo padrão de coloração, porém as células que se infiltram no gel apresentam morfologia senescente caracterizada por fragmentação citoplasmática e picnose nuclear que podem ser observadas até 30 dias de cultivo. No experimento de contração, na presença de soro, as células Vero contraíram o gel cerca de 10% após 1 dia de cultivo. Após 5 dias foi observada uma contração de cerca de 50% , sempre em relação ao diâmetro do gel sem células.Na ausência de soro, com 1 dia de cultivo, as células contraíram o gel em cerca de 7% e aos 5 dias, apenas 15% do diâmetro superior do gel foi contraído. Nossos resultados demonstram que as células Vero aderem, proliferam e infiltram-se no substrato de colágeno, apresentando ao longo do cultivo, alterações na forma celular, caracterizando um processo de diferenciação induzido pelo substrato. As propriedades citoquímicas dos grânulos depositados entre as fibras de colágeno permitem sugerir que sejam compostos por glicoproteínas sulfatadas e/ou carboxiladas. os resultados sugerem ainda que estes grânulos constituam-se de elementos da MEC produzidos e secretados pelas células. As células Vero são também capazes de contrair o gel de colágeno num mecanismo dependente da presença de soro fetal bovino

Abstract: Collagen is widely employed as substratum for cell adhesion and proliferation. Collagen-based substrata may be prepared in different ways, as dry films, floating gel or three dimensional structures. Many cell types undergo morphophysiological alterations when placed on different collagen...

Abstract: Collagen is widely employed as substratum for cell adhesion and proliferation. Collagen-based substrata may be prepared in different ways, as dry films, floating gel or three dimensional structures. Many cell types undergo morphophysiological alterations when placed on different collagen substrata. Not only the presence but also the organization of individual components of the extracellular matrix are important for cells to assume a given phenotype. Another aspect about the behavior of cultured cells is their ability to contract collagen gels, similarly to process occurrings in the dermis during wound healing, in fibrosis, and in connective tissue development .We have here studied the behavior of Vero cells grown on type I collagen gels. Samples were harvested afier 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 days of incubation, fixed in Kamovsky's fixative and embedded in Paraplast Plus. Sections 5 f-tm thick were obtained, dewaxed and stained with either hematoxilin-eosin (HE), toluidine blue at pH 4,0 (AT), xylidine ponceau (XP) or PAS. Parallel experiments were conducted to evaluate the effect of foetal bovine se rum on the cell's ability to contract collagen gels. The cells first adhered to the gel surface and constitute a monolayer afier 24 hours of culturing. The cells were initially rounded but became fibroblast-like and showed intense nuclear and cytoplasmatic metachromasy. Reactivity with XP was observed in the nuclei and cytoplasm and P AS-positive material accumulated in the cytoplasm. Mer 5 days, the cells were fibroblast-like and grew in multiple layers. Foci of cells invading the gel were observed at this time and numerous metachromatic granules were deposited in the gel. These granules were also XP and P AS positive. Longer periods of cell growth resulted in enhanced proliferation and invasion of the gel, but the staining characteristics were preserved. At 20 days, the cells occupied a large extension of the gel, which showed aspects of loose connective tissue. On the 25th. day, the gel surface is highly folded and XP­ stained collagen fibers were mostly aligned featuring the contraction of the gel by Vero cells.showing contraction of the gel by Vero cells. The cells inside the gel presented aspects of senescense, with cytoplasm fragmentation and nuclear picnosis. These aspects were aIs o observed on the 30th.day. In the presence of serum, the cells contracted the gel in 10% and 50% of its previous length after 1 and 5 days, respectively. Without serum the values were 7% and 15% shorter, after 1 and 5 days, respectively.The results demonstrated that Vero cells adhere to, proliferate and invade collagen gels in vitro characterizes a substratum-induced differentiation processo The cytochemical characteristics of the granules entrapped in the gel indicate that they are constituted by sulphated and/or carboxylated extracellular glycoproteins produced and secreted by the cells. It was also shown that the contraction of the gel is a serum-dependent activity of Vero cells