Orientador: Carlos Alberto Flores

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: Este trabalho descreve os efeitos do IFN-'gama' sobre a atividade migratória de neutrófilos e monócitos para a cavidade peritoneal de camundongos; descreve também a relação espécie-específica entre os IFNs-'gama' recombinantes humano e murino, in vitro, bem como seu efeito modulador sobre a...

Resumo: Este trabalho descreve os efeitos do IFN-'gama' sobre a atividade migratória de neutrófilos e monócitos para a cavidade peritoneal de camundongos; descreve também a relação espécie-específica entre os IFNs-'gama' recombinantes humano e murino, in vitro, bem como seu efeito modulador sobre a atividade quimiotática para neutrófilos induzida por LPS, in vivo, e sobre a liberação de fatores quimiotáticos para essas células, por macrófagos peritoneais estimulados, in vitro, pela endotoxina. Tanto o rmulFN-'gama' (150-1350 Ul/animal) quanto o rhulFN-'gama' (150 Ul/animal) nâo foram capazes de induzir migração de neutrófilos ou de monócitos para a cavidade de camundongos, avaliada 12 e 96 horas após a injeção dos estímulos e comparadas ao controle LPS (200 ng/animal) e tioglicolato 3% (1,5 ml/animal), respectivamente. Observou-se também, que em ratos, nenhum dos rlFN-? (humano ou murino) foi capaz de induzir migração de neutrófilos ou monócitos para a cavidade peritoneal desses animais. Os macrófagos peritoneais murinos, in vitro, quando estimulados simultaneamente com rmulFN-'gama' e LPS liberaram em torno de 30 µM de NO2- e esta liberação foi quase totalmente inibida com nitroarginina (NARG, 500 µM). Por outro lado, a estimulação desses macrófagos com rhulFN-'gama' e LPS não causou liberação significativa de NO, mesmo em doses de até 500 ui/ml. A estimulação de células mononucleares humanas com rhulFN-'gama' (20-500 Ul/ml) causou uma liberação dose-dependente de ânions superóxido, entretanto tal efeito não foi observado quando a célula estudada foi o neutrófilo. O rhulFN-'gama' potenciou a liberação desses ânions tanto em células mononucleares como em neutrófilos estimulados por PMA (3 nM), porém, quando o estímulo foi o zimosam, o efeito da potenciação não foi observado. Quando os estudos foram realizados utilizando-se rmulFN-'gama', esta citocina por si só, não causou liberação de ânions superóxido e não foi capaz de potenciar a liberação induzida por PMA ou zimosam, nos dois tipos celulares analisados. Macrófagos em cultura foram capazes de liberar no sobrenadante, após estimulação com LPS (5 µg/ml), um fator que induziu migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. A injeção do sobrenadante de macrófagos estimulados por rmulFN-'gama' e LPS causou uma migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos cerca de 50% menor do que a induzida pelo sobrenadante obtido de macrófagos apenas estimulados com LPS. A dosagem de TNF-'alfa' no sobrenadante de cultura de macrófagos murinos estimulados com LPS (5 µg/ml) ou rmulFN-'gama' (20 Ul/ml), apresentaram valores semelhantes: 3,67 e 3,61 ng TNF/ml, respectivamente. O nível de TNF-'alfa' presente no sobrenadante de cultura de macrófagos estimulados com LPS e rmulFN-'gama' foi cerca de 3,5 vezes maior (12 ng TNF/ml). A administração simultânea de rmulFN-'gama' (150 Ul/animal) foi capaz de, dependendo da dose de LPS ou TNF-'alfa' utilizada, potenciar (1 ng de LPS ou 0,5 ng de TNF-'alfa'/animal) ou inibir (10,100 ng de LPS ou 100 ng de TNF-a/animal) a migração de neutrófilos induzida por esses estímulos, para a cavidade peritoneal de camundongos. Estes resultados mostram que IFN-'gama' não é quimiotático para neutrófilos ou monócitos e seus efeitos são espécie-específicos. O IFN-'gama' possue uma importante função moduladora sobre as atividades citotóxíca e liberadora de citocinas e/ou fatores quimiotáticos por macrófagos e não deve estar participando das etapas iniciais do processo inflamatório e sim na manutenção do mesmo.

Abstract: This thesis describes the effects of IFN-'gama' on the migration of monocytes and neutrophils into the peritoneal cavity of mice and also examines the species specificity of the in vitro actions of human and murine recombinant IFN-'gama' (rhulFN-'gama' and rmulFN-'gama', respectively). In...

Abstract: This thesis describes the effects of IFN-'gama' on the migration of monocytes and neutrophils into the peritoneal cavity of mice and also examines the species specificity of the in vitro actions of human and murine recombinant IFN-'gama' (rhulFN-'gama' and rmulFN-'gama', respectively). In addition, the effects of IFN-'gama' on the chemotactic activity of E. coli lipopolysaccharide (LPS)-induced neutrophils in vivo and on the release of chemotactic factors for these cells by peritoneal macrophages stimulated with LPS in vitro are also examined. Neither rmulFN-'gama' (150-1350 lU/animal) or rhulFN-'gama' (150 lU/animal) were able to induce monocyte or neutrophil migration into the peritoneal cavity of mice when compared with the response caused by LPS (200 ng/animal) and 3% thioglycollate (1,5 ml/animal) 12 and 96 h after injection, respectively. Both recombinant IFN-y were also unable to stimulate cell migration in rats. The simultaneous stimulation of murine peritoneal macrophages in vitro with rmulFN-'gama' and LPS caused the release of NO2" (30 µM) which could be almost totally inhibited by nitroargininr (NARG, 500 µM). When rhulFN-'gama' was replaced with rmulFN-'gama' in the above experiments, no formation of NO2" was detected even at interferon doses of up to 500 lU/ml. The exposure of human monocytes, but not neutrophils, to rhulFN-'gama' (20-500 Ul/ml) resulted in a dose-dependent release of superoxide anions. Furthermore, in both monocytes and neutrophils, the formation of superoxide anions in the presence of phorbol myristic acid (PMA, 3nM), but not zymosan, was potentiated by rhulFN-'gama'. In contrast to these results, rmulFN-'gama' was unable to stimulate superoxide anion formation in these cells and was also unable to potentiate the release in the presence of PMA or zymosam. Upon stimulation with LPS (5 µg/ml), macrophages in culture released a factor which induced the migration of neutrophils when injected into the peritoneal cavity of mice. This migration was inhibited by approximately 50% when the macrophages were co-stimulated with rmulFN and LPS. The levels of TNF-'alfa' in the culture medium of murine macrophages stimulated with either LPS (5 µg/ml) or rmulFN-'gama' (20 lU/ml) were very similar (3,67 vs 3,61 ng TNF/ml, respectively) but were about 3,5 fold lower than the levels observed in macrophages stimulated with LPS and IFN-'gama' (12 ng TNF/ml) of rmulFN-'gama' (150 lU/animal) either potentiated or inhibited the migration of neutrophils into the mouse peritoneal cavity induced by these agents; potentiation occured at LPS and TNF doses of 1 ng and 0,5 ng/animal, respectively, while inhibition was observed at LPS and TNF doses of 10-100 ng and 100 ng/animal, respectively. These results demonstrate that IFN-'gama' is not chemotactic for monocytes and neutrophils and that its effects are species-specific. Furthermore, IFN-'gama' has an important modulatory influence on the cytotoxic and mediator-releasing activities of cytokines and/or of the chemotactic factors liberated by macrophages. IFN-'gama' therefore seems to have a minimal role in the initial stages of the inflammatory reaction but is important in maintaining this process.