Orientador: Stephen Hyslop

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A hialuronidase (Hyase) de peçonha contribui para a difusão da peçonha do local da inoculação. Neste trabalho, foi purificada e caracterizada a Hyase da peçonha da Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae), uma aranha caranguejeira encontrada no sudeste do Brasil. A peçonha obtida por...

Resumo: A hialuronidase (Hyase) de peçonha contribui para a difusão da peçonha do local da inoculação. Neste trabalho, foi purificada e caracterizada a Hyase da peçonha da Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae), uma aranha caranguejeira encontrada no sudeste do Brasil. A peçonha obtida por estimulação elétrica de machos e fêmeas adultas foi fracionada por cromatografia em gel filtração em uma coluna Superdex 75 (tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 6, contendo 0,15 M de NaCl), a um fluxo de 1 ml/min. O perfil de eluição foi monitorado a 280 nm e frações de 1,5 ml foram coletadas e analisadas para Hyase. As frações ativas foram reunidas e aplicadas em uma coluna de afinidade heparin-Sepharose (em acetato de sódio 0,01 M, pH 6). A coluna foi lavada com o mesmo tampão e as proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl (0-1 M). As frações ativas foram agrupadas e avaliadas quanto à pureza por SDS-PAGE e RP-HPLC. O pH ótimo, a estabilidade térmica, a presença das isoformas, e a neutralização por flavonóides e antivenenos comerciais também foram avaliadas. A Hyase foi purificada em duas etapas cromatográficas, com atividade específica de 148 unidades de redução de turbidez (TRU)/mg (peçonha: 36 TRU/mg; fator de purificação de ~ 4). A Hyase apresentou uma massa molecular estimada em 43 kDa por SDS-PAGE, que não foi afetada por ?-mercaptoetanol. Zimografia em gel contendo ácido hialurônico confirmou atividade sobre o substrato. O pH ótimo foi de 4 a 5, com atividade ótima à 37°C. A Hyase manteve estabilidade até 60°C, mas perdeu rapidamente a atividade em altas temperaturas; a atividade se manteve após vários ciclos de congelamento e descongelamento. A atividade enzimática foi totalmente inibida por dois (apigenina e naringina) dos cinco flavonóides testados. A concentração de NaCl (0,05-1 M) não influenciou a atividade. A enzima apresentou maior atividade com ácido hialurônico em relação ao sulfato de condroitina A e foi totalmente neutralizada pelo antiveneno aracnídeo polivalente contra peçonha de aranha-marrom (Loxosceles sp.), aranha armadeira (Phoneutria nigriventer) e escorpião amarelo (Tityus serrulatus), mas não por antivenenos contra peçonha de lagarta (Lonomia obliqua), escorpião (T. serrulatus e Tityus bahiensis) ou serpente (Bothrops, Crotalus e Micrurus). A Hyase aumentou a permeabilidade vascular na pele dorsal de ratos. As propriedades bioquímicas da Hyase foram semelhantes às Hyases encontradas em outras peçonhas. A neutralização pelo antiveneno aracnídeo (mas não pelo escorpiônico) indicou que esta enzima compartilha epítopos antigênicos com enzimas semelhantes em peçonhas de outras aranhas

Abstract: Venom hyaluronidase (Hyase) contributes to the diffusion of venom from the site of inoculation. In this work, we purified and characterized Hyase from the venom of Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae), a large theraphosid found in southeastern Brazil. Venom obtained by electrical...

Abstract: Venom hyaluronidase (Hyase) contributes to the diffusion of venom from the site of inoculation. In this work, we purified and characterized Hyase from the venom of Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae), a large theraphosid found in southeastern Brazil. Venom obtained by electrical stimulation of adult male and female V. dubius was initially fractionated by gel filtration on Superdex 75 (in 0.1 M sodium acetate, pH 6, containing 0.15 M NaCl), at a flow rate of 1 ml/min. The elution profile was monitored at 280 nm and 1 ml fractions were collected and assayed for Hyase. Active fractions were pooled and applied to an affinity column of heparin-Sepharose (in 0.01 M sodium acetate, pH 6). The column was washed with the same buffer and proteins were eluted with a linear gradient of NaCl (0-1 M). Active fractions were pooled and assessed for purity by SDS-PAGE and RP-HPLC. The pH optimum, heat stability, presence of isoforms and neutralization by flavonoids and commercial antivenoms were also assessed. Hyase was purified in two chromatographic steps with a specific activity of 148 turbidity reducing units (TRU)/mg (venom: 36 TRU/mg; purification factor of ~4). Hyase had a molecular mass of 43 kDa by SDS-PAGE that was unaffected by ?-mercaptoethanol. Zymography in gels containing hyaluronic acid indicated that there were no isoforms. The pH optimum was 4-5, with optimal activity at 37°C. Hyase was stable up to 60°C, but rapidly lost activity at higher temperatures and maintained activity after several freeze-thaw cycles. Enzyme activity was completely inhibited by two (apigenin and naringin) of five flavonoids tested. The NaCl concentration (0.05-1 M) did not influence activity. Hyase had greater activity towards hyaluronic acid compared to chondroitin sulphate and was completely neutralized by polyvalent arachnid antivenom raised against brown spider (Loxosceles spp.), banana spider (Phoneutria nigriventer) and yellow scorpion (Tityus serrulatus) venoms, but not by antivenoms to caterpillar (Lonomia obliqua), scorpion (T. serrulatus and Tityus bahiensis) or snake (Bothrops, Crotalus and Micrurus species) venoms. Hyase increased vascular permeability in rat dorsal skin. The biochemical properties of this Hyase were similar to other venom Hyases. The neutralization by arachnid but not scorpion antivenom indicated that this enzyme shared antigenic epitopes with similar enzymes in other spider venoms