Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: Bactérias Gram-negativas (BG-) e seu sub-produto [Lipopolisacarídeo (LPS) - endotoxina) são capazes de estimular células a produzirem citocinas pró-inflamatórias envolvidas na destruíção tecidual periapical. Os objetivos propostos foram: 1) analisar os diferentes métodos de LAL para...

Resumo: Bactérias Gram-negativas (BG-) e seu sub-produto [Lipopolisacarídeo (LPS) - endotoxina) são capazes de estimular células a produzirem citocinas pró-inflamatórias envolvidas na destruíção tecidual periapical. Os objetivos propostos foram: 1) analisar os diferentes métodos de LAL para quantificação de endotoxinas, revelando o (s) que melhor (es) se adapta (m) para investigação de endotoxina nas infecções de origem endodôntica (capítulo 1); 2) estudar o perfil da microbiota e níveis de endotoxinas nas infecções endodônticas primárias com lesão periapical, determinando a antigenicidade do conteúdo endodôntico contra macrófagos através da produção de IL1- ß e TNF-? (capítulo 2); 3) investigar a presença de espécies bacterianas Gram-negativas "alvos" e níveis de endotoxinas nas infecções endodônticas primárias com lesão periapical, determinando seu potencial antigênico contra macrófagos através da produção de PGE2 (capítulo 3); 4) detectar espécies de Treponema spp e os níveis de endotoxinas em infecções endodônticas primárias e determinar sua antigenicidade contra macrófagos através dos níveis de IL-6 e IL-10, avaliando sua correlação com os achados clínicos e radiográficos (capítulo 4); 5) avaliar a atividade antigênica de LPS isolado de P. gingivalis e F. nucleatum encontrados em canais radiculares infectados sobre macrófagos (RAW 264.7) através dos níveis de IL-1? e TNF-? (capítulo 5); 6) comparar "in vivo" a efetividade do preparo químico-mecânico com NaOCl 2.5% e CLX-gel 2% na eliminação de LPS de bactérias orais presentes em dentes com necrose pulpar e presença de lesão periapical (capítulo 6); 7) avaliar o efeito do preparo químico-mecânico com NaOCl 2.5% + EDTA 17% e limas rotatórias NiTi (Mtwo®) na remoção de endotoxinas de dentes com necrose pulpar e presença de lesão periapical (capítulo 7); 8) comparar a capacidade de diferentes sequências clínicas do sistema rotatório Mtwo® na remoção de endotoxinas em canais radiculares contaminados. (capítulo 8). Método: amostras foram coletadas de canais radiculares com IEPL utilizando cones de papel estéreis/despirogenizados. PCR (16s rDNA) e método LAL foram utilizados. Níveis de citocinas inflamatórias foram quantificados através de ELISA (Duoset-Kit, R&D systems). Resultados: Os testes cinéticos (KQCL - Kinetic Quantitative Chromegenic Limulus e turbidimétrico) mostraram níveis de endotoxinas inferiores (7,49 EU/mL e 9,19 EU/mL, respectivamente), quando comparados ao teste QCL (Quantitative Chromegenic Limulus) (34,20 EU/mL) (p<0,05). Prevotella nigrescens (13/21) foi mais frequentemente encontrada. Dente com exsudato foi relacionado com a presença de F. alocis (p<0,05). Correlações positivas (p<0,05) foram encontradas entre: número de BG- e níveis de IL-1 ß, TNF-? e PGE2; níveis de endotoxinas e de TNF-? (p<0,05); IL-1 ß e tamanho de lesão periapical. Endotoxina foi detectada em 100% dos canais radiculares estudados. Maior redução de entodotoxina foi encontrada nos dentes instrumentados com NaOCl 2,5% (57,98%) versus CLX-gel 2% (47,12%) (p<0,05) utilizando limas manuais K-file. Após PQM com NaOCl 2,5% e limas rotatórias NiTi endotoxina foi reduzida em 98,06% (p<0,05). Conclusão: 1) Os testes cinéticos turbidimétrico e cromogênico de LAL apresentaram resultados mais precisos e de melhor reprodutibilidade quando comparados ao QCL (capítulo 1);. 2) A antigenicidade do conteúdo endodôntico não está relacionada apenas com a quantidade de endotoxinas encontrada nos canais radiculares, mas também com o número de diferentes espécies Gram-negativas presentes na infecção. Maior destruíção óssea periapical foi relacionado com níveis elevados de IL-1ß (capítulo 2); 3) O número de espécies BG- presentes nas IEPL foi relacionado com diferentes níveis de secreção de PGE2 via macrófagos. Maior produção de PGE2 foi relacionada com a presença de sintomatologia clínica (capítulo 3); 4) espécies de Treponema spp. exercem seu papel na patogênese das infecções endodônticas primárias. Além disso, o conteúdo bacteriano e particularmente os níveis de endotoxinas presents nos canais radiculares estimularam a produção de IL-6 e IL-10 por macrófagos (capítulo 4); 5) LPS isolados de P. gingivalis e F. nucleatum de canais radiculares infectados estimulam a produção de IL-1? e TNF-?, que são mediadores inflamatórios pleiotrópicos, podendo iniciar a resposta inflamatória e estimular a produção de mediadores secundários envolvidos na destruição tecidual (capítulo 5); 6) PQM com NaOCl 2,5% ou CLX-gel 2% não foram eficazes na eliminação de endotoxinas presentes na IEPL (capítulo 6); 7) PQM com NaOCl 2,5% + EDTA 17% e limas rotatórias NiTi (Mtwo®) foi eficaz na remoção de endotoxinas em 98,06% (capítulo 7); 8) redução significativa de endotoxinas foi obtida utilizando as sequências Mtwo® finalizadas com o preparo apical final #40.04 or #25.07 (capítulo 8)

Abstract: Gram-negative bacteria (G-ve) and its by-product [Lipopolysaccharide (LPS) - endotoxin] are capable to stimulate cells to release proinflammatory cytokines that lead to tissue destruction. The aims of this study were: 1) to determine which of the quantitative methods, namely, chromogenic...

Abstract: Gram-negative bacteria (G-ve) and its by-product [Lipopolysaccharide (LPS) - endotoxin] are capable to stimulate cells to release proinflammatory cytokines that lead to tissue destruction. The aims of this study were: 1) to determine which of the quantitative methods, namely, chromogenic endpoint, chromogenic kinetic and turbidimetric kinetic ones, best fit for the analysis of primary endodontic infections (chapter 1); 2) to investigate the microbial profile and the levels of endotoxin found in primary root canal infection with apical periodontitis (PEIAP), and to determine their antigenicity against macrophages through the levels of IL-1ß and TNF-alpha, evaluating their relationship with clinical and radiographic findings (chapter 2); 3) to investigate target G-ve bacteria species and endotoxin in PEIAP, determining their antigenicity against macrophages through the levels of PGE2 and evaluated their relationship with clinical findings (chapter 3); 4) investigation of Treponema spp. and endotoxin in primary endodontic infection and evaluation of the antigenicity of the infectious content against RAW 264.7 macrophages by the levels of IL-6 and IL-10 production (chapter 4); 5) to evaluate the antigenic activity of LPS purified from P. gingivalis and F. nulceatum isolated from infected root canals on macrophages cells (RAW 264.7) by the levels of IL-1? and TNF-?. (chapter 5); 6) to compare the efficacy of chemomechanical preparation with 2.5% NaOCl and 2% CHX-gel on eliminating oral bacterial LPS in teeth with PEIAP (chapter 6); 7) to investigate the ability of chemo-mechanical preparation (CMP) with 2.5% NaOCl + 17% EDTA and rotary NiTi system Mtwo® in removing endotoxin from PEIAP (chapter 7); 8) Comparison of different clinical sequences of NiTi rotary files Mtwo® in the removal of endotoxin from infected root canals (chapter 8). Methods: Samples were taken from root canals with PEIAP with paper points. PCR technique (16S rDNA) was used for the detection of the target bacteria. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) was used to measure endotoxin. The amounts of IL-1ß, TNF-alpha and PGE2 in macrophages supernatants were measured by enzyme-linked immunosorbent assay - Duoset-kit (ELISA). Results: The KQCL and Turbidimetric -assay yielded a median value of endotoxin of 7.49 EU/mL and 9.19 EU/mL respectively, significantly different from the endpoint-QCL (34.20 EU/mL) (p<0.05). Prevotella nigrescens (13/21) was the most frequently Gram-negative bacteria species detected. Tooth with radiolucent area ? 2mm was related to Treponema denticola. Correlation was found between the number of Gram-negative bacteria and the levels of IL-1ß, TNF-alpha and PGE2 (p<0.05). Increased levels of endotoxin were followed by TNF-alpha release (p<0.05). Higher levels of IL-1ß (p<0.05) and endotoxin contents were related to the larger size of radiolucent area. Elevated levels of PGE2 were found in teeth with tenderness to percussion and pain on palpation. Endotoxin was detected in 100% of the root canals investigated. Higher percentage value of endotoxin reduction was found in 2.5% NaOCl (57.98%) when compared to 2% CHX-gel (47.12%) (p<0.05) using manual K-files. After chemo-mechanical preparation with 2.5% NaOCl and rotary NI-TI files endotoxin was significantly reduced to 98.06% (p<0.05). Conclusion: 1) Quantitative kinetic-turbidimetric and kinetic-chromogenic LAL methods are best fitted for analysis of endotoxin in root canal infection, both being more precise and allowing better reproducibility compared to the endpoint-QCL assay; 2) The antigenicity of the endodontic contents is not related to only the amount of endotoxin found in root canal, but also with the number of different species of Gram-negative bacteria involved in the infection. Moreover larger size (? 2mm) of radiolucent area was related to IL-1ß and endotoxin; 3) Additive effect between the number of G-ve bacterial species involved in endodontic infection regarding the induction of pro-inflammatory cytokine by macrophage cell. Moreover, teeth with clinical symptomatology were related to higher levels of endotoxin and PGE2 secretion; 4) a wide variety of Treponema species do play a role in primary endodontic. Moreover, the bacterial endodontic contents, particularly the levels of endotoxin present in root canals, were a potent stimuli for the production IL-6 and IL-10 in macrophages; 5) LPS of the P. gingivalis and F. nucleatum isolated from root canal infection is involved in the induction of IL-1 ? and TNF-?, which are pleiotropic inflammatory mediators, that can play a role in the initiation of the upregulation of the inflammatory response and can also stimulate the production of secondary mediators involved in tissue destruction; 6) 2.5% NaOCl and 2% CHX-gel were not effective on eliminating endotoxin from the primarily infected root canals using manual K-files; 7) CMP with 2.5% NaOCl + 17% EDTA and rotary NiTi files was effective in reducing 98.06% of endotoxin from PEIAP; 8) substantial reduction of endotoxin contents was achieved by using the Mtwo® sequences finished in APS #40.04 or #25.07