Orientadores: Sérgio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O presente trabalho apresenta a purificação e caracterização bioquímica de uma nova PLA2 neurotóxica nomeada BbilTX-I isolada do veneno da serpente Bothriopsis bilineta. Esta proteína foi purificada através de dois passos cromatográficos, em Sephadex G75 e HPLC de fase reversa C18 (?Bondapak...

Resumo: O presente trabalho apresenta a purificação e caracterização bioquímica de uma nova PLA2 neurotóxica nomeada BbilTX-I isolada do veneno da serpente Bothriopsis bilineta. Esta proteína foi purificada através de dois passos cromatográficos, em Sephadex G75 e HPLC de fase reversa C18 (?Bondapak Watters). A BbilTX-I é uma PLA2D49, com elevada atividade catalítica, massa molecular de 14185,48 Da, e alta similaridade na sua sequência N-terminal com outras PAL2 de veneno de serpentes. A temperatura ótima para a atividade enzimática da BbilTX-I está entre 25Cº e 37 ºC. A fração BbilTX-I é cálcio dependente e tem a atividade enzimática bastante diminuída quando testadas com os íons divalentes. Da mesma forma como outras PLA2 descritas na literatura, a BbilTX-I mostra o pH ótimo em torno de 8. A fração F3 isoladas de crotapotinas crotálicas e a DA2-II extraída do soro de Didelphis albiventris apresentaram um efeito inibitório de mais de 50% sobre a atividade enzimática da toxina BbilTX-I. O efeito da concentração do substrato 4-nitro-3-(octanoiloxi) ácido benzóico sobre a atividade enzimática da BbilTX-I demonstrou que a toxina é uma enzima monomérica com tendência alostérica sugerindo provavelmente um mecanismo de cooperatividade positiva mnemônical. A PLA2 BbilTX-I inserida em preparação isolada de biventer cervicis de pintainho apresentou um efeito bloqueador da transmissão nervosa na junção neuromuscular, em doses de 10, 20, 30 e 50?g/ml e causou 50% de bloqueio em 20 minutos com 10 ?g/ml, 30 minutos com 20 ?g/ml, 22 minutos com 30 ?g/ml e 20 minutos com 50 ?g/ml. Como não houve alteração significativa na resposta ao KCl (usado para detectar danos na membrana celular) e à Acetilcolina (usada para identificar atividade sobre os receptores colinérgicos nicotinicos) podemos dizer que a PAL2 BbilTX-I é uma neurotoxina pré-sináptica não miotoxica, que atua no terminal nervoso da sinapse neuromuscular interferindo sabre a liberação da ACh. A crotapotina F3 isolada do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella e o fator anti-homorrágico DA2-II isolado do soro de Dildelphis albiventris inibiram em 64% e 57% respectivamente a atividade edematizante da fração BbilTX-I demonstrando que a ação inflamatória desta proteína é dependente de sua ação catalítica

Abstract: In this present work we described the purification and functional characterization of a new neurotoxic PLA2, named BbilTX-I from Bothriopsis bilineata snake venom. This protein was by the combination of two chromatographic steps, Molecular Exclusion on a Sephadex lunm and Reverse Phase...

Abstract: In this present work we described the purification and functional characterization of a new neurotoxic PLA2, named BbilTX-I from Bothriopsis bilineata snake venom. This protein was by the combination of two chromatographic steps, Molecular Exclusion on a Sephadex lunm and Reverse Phase HPLC (RP-HPLC) on a C18 ?-Bondapack (Waters) column. BbilTX-I is a monomeric PLA2-D49 showing high purity degree in SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions. The purity of the toxin was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry and shows a molecular mass of 14185.48 Da. BbilTX-I posses a high catalytic activity upon 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzóic acid as a substrate compare with other bothropic PLA2. The optimal temperature and pH for BbilTX-I activity was determinate between 25-37 °C and around 8, respectively. This PLA2 is Ca+2 dependent but others divalent ions significatively reduce its catalytic activity, when pre­incubated with the protein. Also were tested the effects of fraction F3, crotapotin from Crotalus durrisous cascavela, and anti-hemorrhagic factor DA2-Il from Didelphis albiventris opossum sera under optimal conditions; both fraction showed an inhibitory effect over the BbilTX-I catalytic activity. At different concentrations of the substrate this monomeric PLA2 show an allosteric behavior suggesting a positive cooperative mnemonical enzyme mechanism in the catalysis. BbilTX-I showed an inhibitor effect on neuromuscular nerve transmissions on the isolated muscle biventer cervicis. At doses at 10, 20, 30 and 50 g/ml it elicited a blockade of 50% of 20, 30, 22 and 20 minutes, respectively. The effect displayed by BbilTX-I did not with the responses evoked by the addition of KCl (cell membrane damage) and (Ach functionality of cholinergic receptors), thus, we can argue that BbliTX-I is a pre-synaptic neurotoxin impairing the Ach liberation. BbilTX-I shows itself as an edematogenic PLA2 when injected in the mouse right footpad, it elicited a 70% higher than of edema when compare with the control. The edemetogenic activity of this PAL2 is related to its catalytic activity since both are inhibited by F3 crotapotin and DA2-II, 64 and 57% respectively. The reproducibility of biological activity, through the pharmacologic effects, only is possible by the use of chemically homogeneous fractions that hold biological function integrity. This fraction was obtain with high efficiency methodologies like HPLC, mass spectrometry, this result can be associated with the biological activity, disregarding the subjectivity caused by the venom or by impure fractions. This kind of methodologies can be applied to biochemical, structure and function, logical and pharmacological studies, which can reveal unknown mechanism in the function-structure relationship of snake venom PLA2