Orientador: Lício Augusto Velloso

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A ativação da sinalização através do toll-like receptor-4 (TLR4) e a indução de estresse de retículo endoplasmático (ERE) são importantes mediadores da resistência à insulina na obesidade e em outras situações nas quais há um excesso de ácidos graxos saturados. Em um estudo recente,...

Resumo: A ativação da sinalização através do toll-like receptor-4 (TLR4) e a indução de estresse de retículo endoplasmático (ERE) são importantes mediadores da resistência à insulina na obesidade e em outras situações nas quais há um excesso de ácidos graxos saturados. Em um estudo recente, demonstrou-se que sinalização através de TLR4 pode, per se, induzir a ativação de ERE, sugerindo que a ativação do TLR4 é o evento inicial para a indução do estresse celular que contribui para o aumento da expressão de genes de resposta inflamatória. No entanto, os mecanismos que conectam essas duas vias distintas são desconhecidos. As chaperonas GRP78 e GRP94 exercem uma função importante no processamento das moléculas recém-traduzidas do TLR4. Além disso, a chaperona GRP94 é responsável por sua translocação e conteúdo na superfície celular. Durante uma ativação prolongada da via de sinalização do TLR4, a demanda por novas moléculas sintetizadas aumenta, e consequentemente, a demanda por novas chaperonas. Por esta razão, nós aventamos a hipótese de que sob uma ativação extrema da via do TLR4, a síntese de proteínas sobrepujaria a expressão de chaperonas, dessa forma induzindo ERE. Para testar essa hipótese, monócitos da linhagem THP-1 foram incubados com LPS e foi avaliada a expressão e ativação de proteínas responsivas ao ERE por real-time PCR, citometria de fluxo, imunoprecipitado e western blot. Em alguns experimentos, as células foram privadas de glicose ou tratadas com siRNA para aumentar ou diminuir, respectivamente, a expressão das chaperonas. Experimentos de time-course revelaram que o LPS induz um aumento de 2,5 vezes na expressão do TLR4, iniciando após 8 h, com um pico após as 24 h e permanecendo significantemente aumentado após 48 h. A expressão de GRP78 foi aumentada em três vezes com um aumento acentuado após 24 h sem aumento às 8 h, enquanto o GRP94 aumenta apenas 1,5 vezes com um pico após 2 h que retorna aos valores basais após 8 h do estímulo. Não houve aumento da expressão protéica das chaperonas após 48 h. A indução de ERE por LPS foi detectada antes de 4 h do estímulo observado pela avaliação da via da PERK/eIF2a, IRE1 e ATF6 e se mantém ativado após 48 h. Adicionalmente, a privação de glicose em células THP-1 aumenta a expressão de GRP94 e GRP78 em 2,5 e 11 vezes, respectivamente. Na ausência de glicose, o tratamento com LPS não induz ERE. A inibição da expressão das chaperonas por siRNA anula o efeito da privação de glicose em proteger as células do desenvolvimento de ERE induzido por LPS. Portanto, a hiperexpressão das chaperonas GRP78 e GRP94 protegem as células do ERE induzido por LPS. Assim, defeito na expressão das chaperonas induzido por TLR4 é um mecanismo envolvido na integração da sinalização do TLR4 e ERE

Abstract: TLR4 activation and the induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) are two of the most important mechanisms connecting excessive fat with insulin resistance. Recently, it was shown that activation of TLR4 can, per se, induce ERS, suggesting that TLR4 is a primary event in the...

Abstract: TLR4 activation and the induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) are two of the most important mechanisms connecting excessive fat with insulin resistance. Recently, it was shown that activation of TLR4 can, per se, induce ERS, suggesting that TLR4 is a primary event in the induction of the cellular stress that contributes to increased inflammatory gene expression. However, the mechanisms linking these molecular events are unknown. The chaperones GRP78 and GRP94 play an important role during the assembly of newly translated TLR4 molecules. In addition, the chaperone GRP94 escorts the protein to the cell membrane. Under prolonged activation, the demand for newly synthesized TLR4 molecules increases, and thus, the demand for new chaperones. Therefore, we hypothesized that under increased activation of TLR4, the synthesis of the protein would not be matched by the expression of chaperones, thus, triggering ERS. To test this hypothesis, the monocyte cell line THP-1 was incubated with LPS and the expression/activation of proteins involved in ERS was determined by real-time PCR, flow-cytometry, immunoprecipitation and immunoblot. In some experiments, cells were deprived of glucose or treated with siRNA to increase or decrease, respectively, the expression of the chaperones. Time-course experiments revealed that LPS led to a 2.5-fold increase of TLR4 expression starting as early as 8h, peaking after 24h and remaining significantly increased after 48h. The expression of GRP78 underwent a 3-fold increase with a sharp rise at 24h (no increase at 8h), while GRP94 increased by only 1.5-fold with a peak at 2h and an early return to base-line levels. None of the chaperones were increased after 48h. LPS-induced ERS was detected as early as 4h after stimulus as detected by the evaluation of PERK/eIF2?, IRE1 and ATF6 pathways. Strong signals of ERS were still present after 48h. The pre-incubation of THP-1 in glucose-deprived medium produced 2.5 and 11-fold increases of GRP94 and GRP78, respectively. Upon glucosedeprivation, LPS could no longer induce ERS. Inhibition of chaperone expression by siRNA completely abrogated the effect of glucose deprivation to protect cells from LPS-induced ERS. Thus, the hyperexpression of GRP78 and GRP94 protect cells from LPS-induced ERS. Defective TLR4-induced chaperone expression is a mechanism involved in the integration of TLR4 signaling and ERS